Способ определения агглютинации энтеробактерий

(21 (22 (46 (72 Г.М (53 (56 6 8 У 24В.Тупикин и В.Е.Со нов, Д .Граче (088.8 .Б, и В 5,л иофизик 54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯЭНТЕ РОБАКТЕ РИЙ Изобретение относи гии. Цель изобрете очности и чувствитию энтеробактерий с АГГЛЮТ ся иол иявыш льности. Сусшивают 4 ь ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССС ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ 410935 06,08, 30.06. Н.Р.Ива Шуб, К.А 615.36 Жулин Ит.29,разведенной агглютинирующей сывороткой. Пробы анализируют на содержание агглютинатов знтеробактерий,Подс" читывают те агглютинаты, размеры которых 5 мкм или больше. Положительным результатом считают вариант, при . котором количество агглютинатов при втором измерении превышает количество агглютинатов при первом измерении более, чем в 1,3 раза. Способ обеспечивает возможность регистрации реакции агглютинации на основе данных дисперсионного количественного анализа агглютинированной суспензии энтеробактерий.Изобретение относится к медицинской микробиологии, касается вопросов серологического анализа и может быть использовано при диагностике инфек 5 ционных заболеваний и идентификации бактерий.Цель изобретения - повышение точ,ности способа эа счет повышения чувствительности определения, 10Способ осуществляют следующим образом.Суспензию энтеробактерий (концентрация от 10-10 микробных тел/мл) смешивают .с разведенной агглютинирую"15 ей сывороткой в объемных соотношениях 1:10, Целесообразно выбирать объемные соотношения, не превышающие соответственно 0,1 мл и 1,0 мл. При ,этом готовят две идентичные .пробы. 20алее полученные пробы анализируют а содержание агглютинатов энтеробактерий проточным фотоэлектрическим методом путем их количественного подсчета с помощью соответствующего 25 ,устройства. При этом первое иэмере;ние через 1-3 мин проводят сначала с одной пробой, а второе измерение через 20-40 мин от начала реакции с другой пробой, Для анализа каждый 30 ,раз отбирают строго постоянный объем пробы, Перед. измерением отобранный объем разводят ампульным физиологическим раствором так, чтобы разведение вновь полученной пробы было в 10 раз больше исходной, После этого проводят регистрацию количества аг" глютинатов в 1 мл новой пробы. При этом подсчитывают только те агглютинаты, размеры которых достигли или превышают 5 мкм, Положительным результатом регистрации РА энтеробактерий считают вариант, при котором количество агглютинатов определен" ное при втором измерении превышает количество агглютинатов при первом, более чем в 1,3 раза, Во всех других вариантах результат РА считают отрицательным.В предлагаемом способе величина бактериальных агломератов, регистрируемых как агглютинаты энтеробактерий ограничена по размерам нижним пределом, равным 5 мкм. Опытным путем получено, что в процессе агглютинации на начальной стадии реакции преобладающим размером, образующихся в пробе агглютинатов, является величина 7, 5 мкм, что обусловлено слипанием (под действием сыворотки) 5-10клеток энтеробактерий со среднимиразмерами 1-1,5 мкм (верхний пределразмеров регистрируемых агглютинатовне указывается, так как при использовании для постановки РА сыворотокс высокой агглютинирующей активностью,отдельные агглютинаты могут достигатьвеличины, при которой становятся различимы даже невооруженным глазом).Вместе с тем, в анализируемой пробе,наряду с агглютинатами энтеробактерий, образующиеся в ходе РА, возможно наличие спонтанноагглютинировавших бактерий, В неагглютинированныхсуспензиях энтеробактерий максимальные размеры спонтанных агломератовпрактически не превышают 5 мкм и ихколичество может колебаться на фонеобщей бактериальной массы.В силу указанных обстоятельств,с целью исключения артефактов приучете РА регистрируют только агглютинаты, размеры которых5 мкм. Приэтом регистрация агглютинатов с размерами 5 мкм возможна, так как приповременном учете количество спонтанно агглютинировавших бактерий и других частиц (загрязнение) с этими размерами не будет существенно изменяться (экспериментально установлено,что максимальное изменение уровняспонтанной агглютинации в течениевремени регистрации РА не превышает1,3 раза). При подсчете агглютинатов допустимые значения отношений количества агглютинатов при втором измерении И(1 ) к количеству агглютинатов при первом И(1 ), при которыхвозможен положительный учет РА должны быть выше 1,3. При всех значенияхБ(1 )/И(1 )1,3 изменение количества агглютинатов в процессе РА стано"вится сравнимо с колебаниями уровняспонтанной агглютинации, В этом случае достоверность результатов не гарантируется,Регистрируют агглютинацию энтеробактерий при двух отсчетах времени,.Целесообразно проводить первое измерение в интервале 1-3 мин от началаРА. Как известно, в течение первыхтрех минут протекает специфическаяфаза реакции. При этом на первой ми"нуте агглютинации, как правило, непроисходит - реакция характеризуется взаимодействием антител сыворотки с гомологичными антигенами энте 3 140 робактерий. Далее специфическая фаза сопровождается начальной агглютинацией бактерий. Через 3 мин специ" фическая фаза завершается " реакция характеризуется нарастанием количества агглютинатов в пробе. Второе измерение числа агглютинатов в пробе целесообразно проводить через 20 40 мин от начала РА, Это обусловлено тем, что при использовании для постановки РА сывороток с низкими агглютинирующими свойствами (например, разведенной до титра) процесс нарастания количества агглютинатов в пробе значительно растянут во вре" меии. При этом за время 3 (С(20 мин изменение (увеличение) числа агглютинатов в ходе РА может оказатьсяс 1,3, что не позволяет отдифференцировать РА от колебаний уровня спонтанной агглютинации, С другой стороны, возможны случаи, когда через 40 мин количество регистрируемых агглютинатов может существенно снизиться, во-первых, по причине их укруп нения с соответствующим уменьшением количества, во-вторых, в результате возможного эффекта обратимости РА, при котором иэ-за нарушения оптимальности соотношений исходных ингредиентов РА, происходит перегруппировка агглютинатов, сопровождающаяся их частичным разрушением, В силу этих эффектов условие 11(С )/Б(С )1,3 может быть нарушено.Приготовление двух идентичных проб для повременного учета РА необходимо в целях исключения нарушения процесса агглютинации при отборе части пробы для измерения, так как при работе с одной пробой возможны нару" шения соотношения ингредиентов РА. При этом искажается результат анализа.Предварительное разведение исходной пробы перед измерением, обеспечивает разделение агглютинатов друг от друга и дает воэможность учета каждого из них в отдельности, а также позволяет преостановить РА и зарегистрировать мгновенную картину агглютинации в определенный момент времени.Способ может быть реализован на серийно выпускаемом приборе класса ПКЖП р и м е р 1. Регистрируют агглютинацию бактерий рода Яа 1 шопе 11 а. Предварительно готовят две идентичные101520 25 30 3540 45 50 55 денной 1:1600 ампульным физиологическим раствором, Через 1 мин одну из проб разводят в 10 раэ ампульным физиологическим раствором подсчитывают число агглютинатов в пробе проточнымфотоэлектрическим методом.Через 20 мин тем же путем проводят подсчет числа агглютинатов в другой пробе. Па отношению числа агглютинатЬв при первом измерении к числу агглютинатов при втором измерении делают заключение о регистрации РА (положительная).П р н м е р 2, Регистрируют агглютинацию бактерий рода Яа 3.шопе 11 а. Предварительно готовят две идентичные пробы, для чего берут по 0,05 мл стандартного сальмонеллеэного диагностикума - 0 (7) и добавляют по 0,5 мл агглютинирующей сыворотки к сальмонеллам группы С, разведенной 1:1600 ампульным физиологическим раствором. Через 2 мин одну иэ проб разводят в 10 раз тем же физиологическим раствором и проводят подсчет агглютинатов, Установка, на которой проводят измерения, и последовательность операций аналогична примеру 1. Через 30 мин проводят подсчет агглютинатов во второй пробе тем же путем, По соотношению числа агглютинатов при первом и втором измерениях делают заключение о регистрации РА (положительная). Использование предлагаемого способа регистрации агглютинации энтеро" бактерий обеспечивает (по сравнению с известным) воэможность регистрации РА на основе данных дисперсионного количественного анализа агглютинированной суспенэии энтеробактерий, При этом обеспечивается воэможность счета отдельных агглютинатов в потоке пробы, что позволяет увеличить чувствительность способа (в сравнении с известным) на 4-5 порядков. Это дает возможность учитывать практически единичные агглютинаты, образующиеся в пробе в ходе РА, что в сочетании с повременным учетом их количества позволяет существенно по" высить точность (достоверность) регистрируемых параметров. 64884пробы, для чего берут по 005 мл стандартного сальмонеллезного бактериального диагностикума - 0(7) и добавляют по 0 5 мл агглютинируюшей сыворотФки к сальмонеллам группы С 1, развеСоставитель П,Бонарцев Техред М.Ходанич Корректор В.Бутяга Редактор А.Ревин Подписное Тираж 847 Заказ 3185/39 ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г."Ужгород, ул. Проектная, 4 5 1406488 6Предлагаемый способ (в отличие от агглютинации посредством измерения известного) позволяет проводить экс- светорассеяния в пробе, о т л и - пресс-оценку агглютинации энтеробак- ч а ю щ и й с я тем, что, с целью терий, так как обеспечивает возмож 5повышения чувствительности и точносность получения результатов РА в те- ти, регистрацию проводят проточным чение 20-30 мин. фотоэлектрическим методом путем подсчета числа агглютинатов с раэмераф о р м у л а и э о б р е т е н и я ми 5 мкм и вьппе дважды через 1-3 иСпособ определения агглютинации 10 20-40 мин от начала реакции и при энтеробактерий путем обработки сус- увеличении числа более чем в 1,3 рапензии агглютинирующим реагентом с за определяют агглютинацию,энтеро" последующей регистрацией микробной бактерий.