Способ обнаружения и определения мочевины в кормовых дрожжах

(54) СПЛЕНИЯЖАХ е мочевины в сыво цветной реакции с мом. Унифицирова ораторные методы раторное дело, 1974тке нныеиссле-. "ч. 2,9,ы мед. химии ло, 1982 и в Ъъы ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ юл. % 28 ибирская зональная научно- боратория(56) Определеникрови и моче поцетилмонооксиклинические лабдовании. - Лабос. 124 - 125,Храмов В,А. и др. ВопросВ. 4, с. 435,Гуторанов В. ЛаборатоМ. 10, с. 29. Изобретение относится к ветеринарной лабораторной практике, а именно к химикотоксикологическим и госконтрольным ветеринарным исследованиям, и может быть использовано также в микробиологической промышленности при производстве кормовых дрожжей.Кормовой микробный белок производится на основе комплексной химической и микробиологической переработки целлюлозосодержащего растительного сырья. В соответствии с действующей нормативно-технической документацией содержание белка (протеина) определяется по общему азоту, что создает возможность фальсификации по протеину выпускаемой продукции путем введения мочевины на заключительной стадии производства,СОБ ОБНАРУЖЕНИЯ И ОПРЕДЕ ОЧЕВИНЫ В КОРМОВЫХ ДРОЖ(57) Использование; ветеринария, химикотоксикологические и госконтрольные ветеринарные исследования, Сущность изобретения; проводят очистку экстракта из пробы дрожжей гидроокисью меди, постановку реакции в смеси серной и орто-фосфорной кислот по объему 25 и 10;б, соответственно, содержащей 100 мг 0 диметилглиоксима. Для расширения предела. прямолинейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией мочевины при определении массовой доли мочевины постановку реакции проводят в указанной смеси, дополнительно содержащей 8 - 10 мг 00 тиосемикарбазида. 1 з,п.флы, 2 табл. Кормовые дрожжи содержат много трудноустранимых пйгментов,. липидов, белков и других мешающих определению веществ, а используемые при определении мочевины способы депротеинизации биологических жидкостей для исследования О дрожжей не пригодны;Для определения содержания мочеви- (Я ни в биологических жидкостях Гкровь, ллвз. ма и сыворотка крови, моча) применяют уреазный и диацетилионооксимовый (ДА вгвй МО) несложные и быстрые методы . Особенно широко используют унифицированный метод определения мочевины по цветной реакции с ДАМО,Однако для надлежащей очистки экстрактов из кормовых дрожжей и получения высокоочищенных фильтратов не пригодны условия и реагенты (трихлоруксусная или10 15 20 сульфаниловая кислота), широко применяемые для очистки (депротеиниэации) биологических жидкостей. Экстракты иэ кормовых дрожжей подлежат не только депротеиниэации, но и депигментации, что требует применения более жестких условий их осуществлени с использованием других реагентов, которые, в свою очередь, делают невозможной постановку ДАМО реакции из-за высокой интерференции и низкой чувствительности,Известен также способ определения мочевины в биологических обьектах с ис.- пользованием диметилглиоксима (ДМГ), в котором, используя малоизвестную тиосемикарбазидную (ТСК) модификацию реакции фирона, В,А,Храмов и др. вместо ДАМО (2,3-бутандионмонооксим), в качестве реактива на никель применяют ДМГ (2,3-бутанметилглиоксим, диацетилдиоксим), а в качестве реактивной смеси - 25-ный раствор серной кислоты,Однако указанный способ имеет малый диапазон линейной зависимости между оптической плотностью цветной реакции и концентрацией мочевины в реакции, большую лабильность реакции от условий ее выполнения, высокую интерференцию и низкую чувствительность; а условия фотометрии не оптимальны,Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является диметилглиоксимовый методопределения содержания мочевины в биологических жидкостях, включающий депротеинизацию, центрифугирование (фильтрование), прибавление к центрифугату катализатор-кислотной смеси и раствор ДМГ, перемешивание; нагревание в кипящей водяной бане, охлаждение, постановку эталонной пробы со стандартным раствором мочевины, измерения оптических плотностей при 510-550 нм в 10 мм кювете против контроля на реактивы и вычисление результатов по порции.Недостатком известного способа является то, что мягкие условия депротеинизации, а тем более с использованием 5 О-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУК), не обеспечивает необходимой степени депигментации и депротеинизации экстракта из навески кормовых дрожжей с получение высокоочищенных от мешающих определению веществ фильтратов (центрифугатов). Диапазон линейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией мочевины ограничен, Способу присущи высокая интерференция, низкая специфичность и, особенно, чувствительность реакции. Также отсутствуют методы обнаружения и 25 3035 40 45 50 55 полуколи ественноо определения мочеви ны, которые исключали бы необходимость определения в случае ее отсутствия, а при наличии ее давали бы возможность правильно выбрать концентрацию стандартного (рабочего) раствора мочевины для подстановки эталонной пробы (реакции).Целью изобретения является увеличение чувствительности способа определения мочевины. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу проводят очистку (депиг ментацию и депротеинизацию) экстракта из пробы дрожжей гидроокисью меди, постановку реакции в смеси серной и арто-фосфорной кислот по объему 25 и 10 соответственно, содержащей 100 мгдиметилглиоксима, а фотометрию - при 490 нм (при обнаружении). Для расширения предела прямолинейной зависимости между оп. тической плотностью и концентрацией при определении массовой доли мочевины постановку реакции проводят в смеси указанных кислот с диметилглиоксимом, дополнительно содержащей 8-10 мго тиосемикарбазида, а фотометрию - при 540 нм.Сущность способа состоит в том, что мочевина в сильнокислой среде с диметилглиоксимом образует желтый комплекс, а при дополнительном присутствии тиосемикарбаэида - красный комплекс, которые фотометрируют при 490 и 540 нм соответственно.Для полуколичаственного определения и повышения достоверности результатов обнаружения за счет исключения влияния на результаты измерения возможной остаточной интерференции на нижней границе чувствительности, наряду с полноценной ставят неполноценную реакцию (беэ ДМГ), с последующей фотометрией при 490 нм (Д 2 . В положительных случаях вычисля 490ют полуколичественное содержание моче- вины в дрожжах по полученным значениям оптических плотностей, используя выведенные экспериментальным путем коэффициенты (например, 2,9 для навески пробы 0,5 г и 3,6 для навески 1 г). В сомнительных случаях обнаружения вычисляют соотношение значений полученных величин оптических плотностей полноценной и неполноценной реакций (Д 1 :Д 2 . кото 490, 490 рые при отсутствии мочевины в пробе менее 3,7 для навески 0,5 г и менее 4,1 для навески дрожжей 1,0 г.При определении массовой доли ставят эталонную пробу с концентрацией мочевины в стандартном растворе, близкой к массовой доле исследуемого вещества в исследуемой пробе (по результатам полуколичественного вычисления), а вычислениепроводят по принципу пропорций,Предлагаемый способ отличается отизвестного методом депротеиниэации содновременной депигментацией с использованием гидрата окиси меди, составом реакционной смеси как по концентрациямкислот, ТСК и ДМГ, так и по составу (отсутствие железа хлорного), увеличением предела линейной завйсимости между 10оптической плотностью и концентрациеймочевины, уменьшением времени экспозиции в кипящей водяной бане, максимальнойприближенностью концентрации эталонного раствора к исследуемой пробе. Кроме 15того, предлагаемому способу присущи качественное определение (обнаружение) мочевины, в котором возможное влияниеинтерференции на результаты исследова-ния учитывается путем постановки реакции 20на пробу без ДМГ, измерения оптическойплотности и вычисления соотношенияоптических плотностей полноценной инеполноценно реакцией, а также полуколичественное вычисление мочевины по измеренной оптической плотности и выводимымэкспериментальным путем коэффициентам,П р и м е р, Получение экстракта (вытяжки), Навеску пробы массой 0,5 или 1,0 г взвешивают с погрешностью не более 0,002 г, 30помещают в фарфоровую ступку и тщательно растирают пестиком в течение 2 - 3-х мин,Приливают 1-2 см воды и продолжают расзтирать 2 - 3 мин. Затем приливают 8 - 10 смдистиллированной воды и с помощью пестика смывают растертую массу с поверхности ступки и пестика. без потерь суспензиюпереносят в химический стакан вместимостью 150 - 200 см . Остатки суспензии иззступки трижды смывают по 10 см воды в 40стакан, Суспензию в стакане оставляют стоять при периодическом перемешивании икомнатной температуры в течении 5 - 10 чили в холодильнике до следующего дня,Депротеинизация, депигментации экстракта и получение фильтрата.Суспензию (экстракт) пробы хорошо перемешивают, приливают 25 см 6 о -ногораствора меди сульфата, перемешивают,оставляют стоять 5 - 10 мин, Затем приливают 25 см 1,25 о -ного раствора гидроокисизнатрия, перемешивают, оставляют стоять2 - 3 мин, повторно перемешивают, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см,.доводят содержимое колбы водой до метки, 55перемешивают и фильтруют через бумажный фильтрЗатем проводят доочистку полученногофильтрата, Для этого к фильтрату при постоянном перемешивании стеклянной палочкой приливают по каплям 33-40 -ныйраствор гидроокиси натрия до рН 9,0-10,0,Выпавший осадок меди гидроокиси отфильтровывают через плотный бумажныйфильтр, а доочищенный фильтрат подкисляют серной или смесью серной и орто-фосфорной кислот до исчезновения голубогооттенка,Обнаружение и полуколичественное определение мочевины.Для проведения испытания применяютколориметр фотоэлектрический КФК - 2,ФЭКили другого типа с наличием светофильтров с максимумом пропускания 490 и540 нм; смесь кислот (серной концентрированной - 25 см, орто-фосфорной - 10 см,зводы дистиллированной - 53 см; смесь рез,активов; к 88 см смеси кислот приливают 10зсм 1-ного раствора диметилглиоксимаз(ДМГ) на 96-ном этаноле, перемешивают ипри необходимости, спустя 5 - 10 мин фильтруют через стеклянный пористый фильтр(используют в день приготовления),Проведение обнаружения,В четыре пенициллиновых флакона вносят по 1 см доочищенного фильтрата прозбы, в два из которых приливают по 4,5 смсмеси зоеактивов с ДМГ, а в два других - по4,5 см смеси кислот (без ДМГ). Флаконызакрывают резиновыми пенициллиновымипробками, хорошо перемешивают содержимое и вместе со штативом ставят. в кипящуюводяную баню (стерилизатор электрический) на 40 мин. Для уменьшения испарениясодержимого флакойов пробки сверху покрывают слоем полиэтиленовой пленки,.затем поролоном (1,0 - 1,5 см толщиной) иметаллической пластинкой (крышкой стерилизатора) с грузом.После нагревания пробы немедленноохлаждают в холодной воде, содержимоефлаконов повторно хорошо перемешивают,Измерение оптических плотностей каждой реакции проводят при 490 нм в 10.ммкювете против воды. Получают 01оптическую плотность и 4 сследуемой (пдЛноценной) реакции и 02 - оптическуюплотность неполноценной (без ДМГ) реакции. Учет качественной реакции.За положительную реакцию на мочевину принимают наличие желтой окраски, интенсивность которой четко превышает интенсивность окраски неполноценной,В сомнительных случаях вычисляют соотношение значений измеренных величин оптических плотностей. При отсутствии мочевины, когда Д 1. :Д 2 составляет менее490, 4903,7 для навески 0,5 г и 4,1 для навески 1,0,дальнейшая количественная оценка и определение мочевины не требуются.Вычисление полуколичественное,По величинам значения оптическихплотностей (д 1 и д 2 О), используя предлагаемые соответствующие коэффициенты(2,9 для навески около 0,5 г и 3,6 для навескиоколо 1 г), вычисляют значение величиныпредполагаемой (возможной) оптическойплотности, которая характеризует интерференцию при 490 нм, Затем вычисляют 4 оазницу между фактически полученной Д 1 иустановленной путем вычисления величиной возможной (предполагаемой) оптической плотности Полученный результат 15указывает на полуколичественное содержание.(Х, %) мочевины в пробе.Например, при массе навески пробы дрожжей кормовых 0,5 г, общем обьеме доочищенного фил ьтрата 100 см", Д 1"=0,110, 20Дг =0,024. Тогда 0,024 2,9=0,0692 -предполагаемая оптическая плотность засчет интерференции; 0,110-0,692=-0,04 г -содержание мочевины в 100 г дрожжей, т.е,0,04% мочевины в кормовых дрожжах(фактическое содержание 0,05%).Определение массовой доли мочевины,Для проведения испытания применяютсмесь реактивов: к 88 см смеси кислот призливают 2 см 0,4%-ного раствора тиосемизкарбазидной (ТСК) и 10 см 1%-ногораствора ДМГ на 96 О-ном этаноле; основнойстандартный раствор мочевины с содержанием 100 мг/100 см, Рабочий исходныйзстандартный раствор мочевины готовят путем разведения основного в 20 зоаз (5 смзосновного и 95 см воды), в 1 см которогозсодержится 50 мкг мочевины. Другие рабочие стандартные растворы мочевины готовят путем разведения исходного: 40В табл, 1 приведены стандартные растворы.При необходимости доочищенныйфильтрат дополнительно разбавляют водойв 2 раза (при навеске 0,5 г буцет соответствовать общему обьему 200 см или соотношению 1:400).Проведение испытания,В лзва пенициллиновых флакона вносятпо 1 см дистиллированной воды, в два флакона - по 1 см фильтрата пробы и в двазфлакона - по 1 см рабочего стандартногозраствора. Содержание мочевины в рабочемрастворе должно быть близким к определяемой в пробе массовой долей мочевины, 55предварительно обнаруженной полуколичественным способом (например, 0,04%).Во все флаконы приливают по 4,5 смсмеси реактивов (смесь кислот, ТСК и ДМГ),флаконы закрывают резиновыми пробкамис отверсзиями для выравнивания давления, хорошо перемешивают содержимое и вместе со штативом ставят в кипящую водяную баню (стерилизатор электрический) на 20 мин (точно), В водяной бане пробки сверху покрывают полиэтиленовой пленкой, затем поролоном (1-1,5 см толщиной) и металлической пластинкой (крышкой) с грузом. После нагревания пробы сразу же охлаждают в холодной воде, содержимоефлаконов перемешивают. Измерения оптических плотностей каждой реакции проводят при 540 нм в 10 мм кювете против воды,Обработка результатов.Массовую долю мочевины (Х, %) вычисляют по формуле Х % где Д 1 - оптическая плотность искомой массовой доли мочевины;,Дг - оптическая плотность известноймассовой доли мочевины;С - массовая доля мочевины в пробе,соответствующая известной оптическойплотности (Д 2), %До - оптическая плотность реакции нареактивы (реакции с водой).Пример вычисления:Оптическая плотность реакции на реактивы (реакции с 1 см воды): ДО=0,129;До=0,131,Оптическая плотность реакции на пробу(реакции с 1 см фильтрата пробы): Д 1=0,203зи Д 1=0,207,Оптическая плотность реакции с рабочим стандартным раствором (реакции с 1зсм рабочего стандартного раствора, соответствующего 0,04% мочевины); Д 2=0,214 иД 2=0,216,Тогда,074004 0 06, 0,214 - 0,129 0 04 - 0 076 0 04 - о 0,216 - 0,131 0,065 Среднеарифметическое - 0,0353%, За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое результатов двух параллельных определений,Результаты исследования во времени (6дней) проб кормовых дрожжей без и с точными добавками мочевины на пределе чувствительности (0,01 и 0,02%) способа: приведены в табл, 2,Из табл. 2 видно, что способу-прототипуприсущи высокая интерференция и низкая1751675 10 Таблица 1 Массовая оля мочевины в иссле емой п обе, О Номер стандартного раствораКонцентрациямочевины в стандартном рабочем растворе,мкг/см и и объеме экст акта 100 см при объеме экстракта 200 см иэ навески 0,5 гиз навески 0.5 г. из навески 1,0 г 0,500,250,1250,050,0250,0125 1,00 0,50 0,25 0,10 0,05 0,025 2,00 1,00 0,50 0,20 0,10 0,05 50,0 25,0 12,5 5,00 2,501,25 1 2 3 4 5 6 чувствительность, Предлагаемый способ характеризуется малой степенью разброса(Я), высокой сходимостью (Ях), существенностью разницы (1) и достоверностью (р 0,0001), Коэффициент вариации (Ч, ) ха рактеризует высокую восирбизводимость предлагаемого способа по сравнению с прототипом, что указывает на относительно низкий разброс результатов (чем меньше, l О , тем выше воспроиэводимость и сходи мость результатов исследования).Чувствительность способа, характеризующая способностью выявлять наименьшее различие между двумя концентрациями (массовыми долями) исследуемого вещест ва, согласно данным табл, 2, характеризуется высокой величиной отношения разности между результатами определения к разности измеряемых концентраций (ЛД: ЛС), где ЛД - показатель прибора (оптическая 20 плотность); Л С - массовая доля (концентрация) определяемого вещества. На высокую чувствительность также указывает показатель минимальнойконцентрации (Смин, определяемой по Браунсберг-Джамесу. 25В высокобелковых и интенсивно окрашенных кормовых дрожжах чувствительность предлагаемого способа определения мочевины высокая (нижняя граница чувствительности 0,01 г/100 г, минимальная чув ствительность по Браунсберг-Джамесу с Я; /п =0,0065 - 0,0085, по. ЛД: ЛС=0,87) принавеске дрожжей 1 г, общем объеме экстракта 100 смз, депротеинизации и депигментации гидроокисью меди, доочистке 35 фильтрата, 0,5 - 1 см фильтрата в ,5 см реакционной смеси, типе аппарата ФЭК 56 М или КФК(светофильтр 540 нм), толщине рабочего слоя кюветы 1 см, диапазоне линейной зависимости 0,5 - 50 мкг, 40 Преимущества предлагаемого способа состоят также в том, что использован доступный дешевый реактив (ДМГ) отечественного производства. Стабильность развившейся цветной реакции позволяет выполнять анализы большими сериями, а простота постановки реакции дает возможность использовать ее в автоматическйх анализаторах.Предлагаемый способ обнаружения и определения мочевины в кормовых дрожжах может быть использован в ветеринарной лабораторной практике при химико-токбикологическйх й "госконтрольных исследованиях, а также в микробиологической промышленности для интенсификации производства кормовых дрожжей. Формула изобретения 1, Способ обнаружения и определения мочевины в кормовых дрожжах путем получения экстракта, его очистки, постановки реакции при нагревании в смеси серной и орто-фосфорной кислот, содержащем диметилглиоксим, и фотометрии, о т л и ч а ющ и йс я тем, что, с целью увеличения чувствительности, очистку экстракта проводят гидроокисью меди, а содержание серной и орто-фосфорной кислот по объему составляет 25 и 10 осоответственно при содержании 100 мг % диметилглиоксима, а фотометрию проводят при 490 и 540 нм.2. Способ по и. 1, о тл и ч а ю щи й с я тем, что, с целью определения массовой доли,и расширения предела прямолинейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией мочевины, смесь дополнительно содержит 8 - 10 мг % тиосемикарбазида,1751675 Твблицв 2 Ствтистические денные по оптической плотности (Д) и массовой доле мочееины, г/100 г(5 5 см ревкционной смеси 1 см вытежки 1:100. фотомстрич всм кювете при 540 нм). Дрожжи с добавкой 0,01 )1.ной мочееины Пробы сдобве кой 0,02 -ной мочееины Ствтистические поквэвтелиХолостве ревкцие нв и об ожжейпо прототипу по предлвгвемому и опо прототипу по предлвгвемомуп мвс.доле мвс.доле мвс.доле мвс.доле 22 0.15760 0 0,1061 0,0051 0.0250 0,0012 0 0 3,4 Составитель З.ОлейникТехред М,МоргенталКорректор Т.Вашкович Редактор А.Лежнина Заказ 2688 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно. издательский комбинат "патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 5ВхРЧЬД:ЬССиен м5: тгй 180,219 интерфер. 0,0933 0,0220 0,27 О,42,6 0,0059