Способ получения антисыворотки к инсулину

дания (прике или СУДДРСТОЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРО делАм иэОБРетений и ОткРытий ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ(71) Институт биоорганической химииАН БССР(56) Ляшко К.Я МихайлоДреваль А.В. Эксперимент е получение антиинсулиновой сывороткиу морских свинок и ее пр ческоеприменение в радиоиммунологическомметоде определения инсули Лабораорное дело, 974, В 2, с 85) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АННСУЛИНУ) Изобретеи медицинелучения антиедн аз наченныраэноиопределеплазме ние относится к биохиточнее к способам сывороток к гормонам,м для разработки и соэ ммунологических систе нии гормонов в сывор ,рови); как компоне ЯО 1349046 радиодиагностических наборов дляопределения гормонов при их серийнопромышленном выпуске; для анализагормонов другими иммунологическимитестами, - иммунопреципитацией, иммуноэлектроФореэом и пр, Цель изобретения - повышение титра сыворотки.Для этого инсулин эмульгируют с рав,ным объемом полного адьюванта Фрейда, чередуют его введение с введением инсулина, ковалентно связанногос сефарозой, активированной бромцианом, или коныогированного с гидроокисыо алюминия. Эти антигенные смеси вводят внутрикожно во множествоточек спины и шеи. Весь процесс иммунизации состоит из 10-ти циклов.Хорошие характеристики полученных антисывороток к инсулину позволяет испольэовать их в иммунологических методах для анализа инсулина,в частности в методах иммунодифФУзии (иммунопреципита агаре иагароэе, иммуноэлектр э и др.).Настоящее изобретение относитсяк биохимии и медицине,а именно к способам получения антисывороток к гормонам,которые могут быть использованы приразррботке и создании радиоиммунологических систем для определения гормонов в сыворотке (плазме) крови;как компонент радиодиагностическихнаборов для определения гормонов приих серийно-промышленном выпуске;для анализа гормонов другими иммунологическими тестами - иммуиопреципитацией, иммуноэлектроФорезом и пр.Целью изобретения является повышение титра сыворотки,Зто достигается тем, что введение инсулина эмульгированного вполном адъюнанте Фрейда чередуют сннедецием инсулина, ковалеитно связанного с сефароэой, активированнойбромицианом, или коньюгированного сгидроокисью алюминия, причем названные антигенные смеси вводят внутрикожно во множество точек спины ищеи.П р и м е р. Приготовление антигена для иммунизации.Ацтцген 1. 5 единиц (0,2 мг)инсулина растворяют в 0,3 мл стерильного Физиологического раствора, Дляполного растворения инсулина добавляют к этому раствору 10-20 мкл 0,1 Нсоляной кислоты. Полученный растворинсулина тщательно эмугируют с0,3 мл (равным объемом) полного адьюнанта Фрейда. Такую антигенную смесьиспользуют для первого введения прииммунизации. Антиген 1 для третьего,пятого и нечетных введений готовятаналогичным способом из расчета на5 единиц инсулина 0,3 мл Физиологического раствора и 0,3 мл полногоадьюнанта Фреида.Антигец 11. ИнсУлин - ВгСИ-сеФароза,Посадку инсулина на сефароэупроводили по известной методике.ЛиоФилцзонанный препарат ВгСИ - сеФароэы суспеидируют в 1 щМ НС 1,дают набухнуть в течение 5 мин ипромывают тем же раствором от консернирующих добавок. Количество ее берутиэ расчета посадки 5-10 мг белка намл влажного сорбента с учетом того, что 1 г лиоФилизированной себароэы набухает до объема 3,5 мл.После промывки обменник переводятв 0,1 М раствор ЯаНС 0 з (рН 8,3) с 5 1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 О 5 ЪаС 1, В этом растворе обмецнцк(1,4 г или 4,9 мл) н течение 2 чперемещивают с 50 мг иц. пана (раствор ацтигеца 5 мг/мл) на нстряхивателе при комнатной температуре (или втечение ночи ца холоду). После окончания посадки антигена блокируют незанятые им активные центры сорбецта.Лля этого гель обрабатывают такимже образом н 1 М растворе этацоламина или 0,2 М растворе глццица прирН 8. Затем избытки белка и блокирующего агента отмывают тем же раствором бикарбоната с солью, пото 0,1 Мацетатцым буФером (рН 4) с добавкой0,5 1 1 д 1 аС 1 и снова бикарбонатом,Тммуцосорбецт переводят н 0,01 МФосФатцый буФер (рН 7,0) с 0,15 ММаС 1,Готовят суспензию, где степень посадки инсулина 1 мг/мл. Полученныйтаким образом ацтиген вводят н количестнах; приведенных в схеме 1, иэрасчета, что в 0,1 мл суспецзии содержится 0,1 мг инсулина,Инсулин, кошдюгцроваццый сгцдроокисью алюминия,Для перного ннедецця антигон готовят следующим образом: 0,3;г инсулина растворяют н 0,3 мл физиологического стерильного раствора ц до -бавляют 0,3 мл 17.-цой гидроокисцалюминия, нсе тщательцо перемегцвают,1/-цый раствор гцдроокцсц люмцццяготовят перед употреблением иэ концентрированного раствора гцдроокцсиалюминия. Для всех последующих введений антиген берут в количествах,указанных в схеме 1, из расчета0,1 мг инсулина ца 0,1 мл сЪцзцологического растнора.Проведение иммунизации,Процесс иммунизации состоит из1 О циклов.Первый цикл иммуццзации включалцестикратцое вцутрикожцое введениено множество точек спины и щеи антигенного материала каждые 3 неделипо следующей схеме:Введение мг . ацтиген1-ое 0,25 Т2-ое 0,3 113-ое 0,35 Т4-ое 0,40 ТТ5-ое 0,45 16-ое 0,5 ТТКоличество вводимых компонентовантигенцой смеси дается в расчете на1 животное,пои этом 1 ед, =0,0408 мг313490 инсулина, Второй и все последуюте цикгты (до 10) состоят иэ однократного введения каждые 30 дцей ацтигецд 1 (четные циклът) илт ацтигена 11 (нечетные циклы) в дозах 0,3 мг иц 5 сулина. Взяте крови для тестирования проводят путем кардиальной пункции на 7-10 день после очередного введения антигена. 10В тгсследуемо дцтисыворотке рддиоиммунологическим методом определяют:1, Титр антттсыворотки (величицу,обратную тому разведению антисыворотки, которая вызывает свлзътвдцие50 Е 1 - иттсрмнд в аналитическойт 5тест-системе),2, Константу ассоцаттт (характеризует сродствоантител к ацтигену),3. Ст ецифичцость антител (оттетттваетсц процент перекрестной редкццис другими структурно-родственнымисоедин тттллтт - протцсулином, глюттдгоном, С-цептидом),Титр антисыворотки после первого О ции,В ре тультдте предложенного метода полу ц ты в.сокоснецифичные (перекрестцдл р,.акция с проицсулицом не более 10,";, с глюкагоцом - 0,3, с С-пептидом - 0,05 Я), высокоаффинцые (константа дссотваии це нижэ штстта иммунизации в пределах1:10000 - 1:30000; через 7-9 теслцев 1; 70000 - 1: 100000; через 10-12месяцев 1:100000 - 1:250000, гто позволлло в радиоцммуцологическойтест -сстеме лля определения иттсу:т- на доводить развецецие антисыворотки(рабочий титр) до 1: 400000 - 1: 1000000,Величина константы ассоцидпитЗц5равна 1,02-1,73 О л/мол.Перекрестнал реакция с проинсулином не более 107., с глюкагоцомО,ЗЛ, с С-цептидом - 0,052, что говорит о высокой специфичности получен- дОных ацтител.Кроме того, антисыворотки тестировалц методом двойной иммуцодцффуэии по Оухтеттттотт. Атттисывороткддттдци еттттоттетую полосу преципитаитти с ицсултцо и не реагировали спроицсу з;ц т,Иэ 1 О жттттотттьх, вэлтых в эксперимент, и.реэ 12-15 месяцев иммунизации остдгдлось в опыте 8, две свинки 50потибли в момент взятия крови через9-11 месяцев после начала иммунизаЬ 61,02-1, 75 1 О тт/.отть) ц цътсокоактит:цые дцтителл (рдт чцй титр антисчРэротктт в ттялиттвской тест сис э еме 1:800000-1000000), оторые удовлетворяют т ебовднтль, ттредълвллемым к ацтисывороткам, используемым для радиоцммуцглогического аналиэа. Использование вцутрикожнътх чередуютцих введений инсулина с депонируюпттли адьювдцтдмц поэволттло в эксперименте практически исключитьлет дльцост т жт вот ттттх от р а э вития тттдбетической комы,Состояние иммунологической толерацтности к ицсулцтту возникает через 6-8 месяцев после цдчдла иммуниза- ттии. Рдзттттте этого состояния суттес гвецно огрдцичттвдет воэможность эксперимента, тдк кдк у морской свин" ки одцокрдтно ктожтто взять лтттть в сред.цем 5-8 мл крови, что ддет выход д ттисьворотк 2-4 мл, По тому удлиттецие периода ттътработки н сокоактивтп,тх антител до2 - 15 тесттел путем испольэоттанил предложенцого сособа втедея ацтнгецд создает болт.пой экоцомичесъий эффект.Утел тетте пр одо.ткттельности периода выработки въсокодкттвттьтхантител без наступления состоявя иммутологической то.тсрдтттности позвопттло потучить анти сттвороткц с вът сокими ттрдкт и улучт.титымц ацалитиче,.кими параметрами, Кроме того, в этот период иммунизации озможно создать запасы антцсывороткц. Это обстоятельство особеццо важно для обеспеченцл серийцо-промъцллецного выпуска наборов реактивов длл радиоиммунологического определетттл инсулина, Хоротте характериститэ получентгтх днтисывороток к тцсулину позволяют испольэовать их и в других иммунологических методах длл анализаинсулина, в частности методах иммунодиффузиц (иммунопрецтлтттцтя в агаре и дгароэе, иммуцо этц ктрофорез)Формула изобретенияСпособ полученил дцтисывороткик инсулину путем иммуциз,ттцц морских свинок инсулином с полным ддъювантом фрейнда, от ли чдюти й ся тем, что, с целью ттовыти цл титраЗакаэ 3401 Тираж 655 Подписное ННИИПИ Государственного комитета СССР по делам нэобретеннй и открытий 113035, Москва, Ж, Раувская наб., д, 4/5Проиэводственно-полиграическое предприятие, г. ужгород, ул. Проектная, 4 сыворотки, животнык дополнительноиммунизируют комплексом инсулина сгидроокисью алюминия и комплексом349046 бинсулина с сефароэой, при этом имму-, низацим осуществляют во множество точек спины и шеи подкожно.