Способ определения активности трипсина

СООЗ СОВЕТСНИХсоцидлистичеснихРЕСПУБЛИК 20224 2 1/38 С. 01 Б 33/ ЫЙ КОМИТЕТ СССРОбРЕТЕНИЙ И ОТКРЬП ГОСУДАРСТ ПО ДЕЛАМ САНИЕ ИЗОБРЕТЕН(71) Институт экспериментальной биологии АН АрмССР(56) Рябушко Т.А., Вечер А.С. Прикладная биохимия и микробиология,1965, т. 1, в. 6, с, 645. ОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ретение относится к биохиизобретения - ускорение ие чувствительности способа, инки засвечивают, проявляют, фиксируют и обрабатывают раствором дансилхлорида в смеси ацетона с бикарбонатным буфером. Промывают в. ацетоне, спирте, воде и высушивают. Исследуемый препарат наносят на фиксированную и высушенную поверхность желатинового слоя фотопластинки, ин" кубируют, Пластинки промывают и просматривают в ультрафиолете, регистрируя зоны лизиса. В ряд проб с различным разведением трипсина добавляют известное количество ингибитора трипсина,инкубируют смесь и наносят напластинки, Количество трипсина определяют по степени проявления зон лизированного желатина. Максимальная чувствительность пластинок к трипсину сос- ф тавляет 0,1 нг в 1 мкл. 1 з.п.ф-лы.Изобретение относится к биохимии,а именно к способам определения активности трипсина и его ингибитора,и может быть использован в медицинедля определения трипсина в диагностичеСких целях.Цель изобретения - ускорение и повышение чувствительности способа засчет Использования в качестве субстрата поверхностно-модиФицированного 10Флюоресцирующим реагентом - дансилхлоридом (диметиламинонафталинсульфонилхлоридом) ультратонкого слоя желатина.Способ осуществляется следующимобразом.Фотопластинки засвечивают, проявляют, фиксируют и обрабатывают раствором дансилхлорида в смеси ацетон -бикарбонатный буфер 9:1, последовательно промывают в ацетоне, спирте,воде и высушивают.Исследуемый препарат наносят нафиксированную и высушенную поверхность желатинового слоя Фотопластин 25ки, затем инкубируют во влажной камере. После инкубации пластинки тщательно промывают и просматривают в ультрафиолете, регистрируя зоны лизисав виде темных пятен на фоне желтозеленой Флюоресценции.Для количественного определениятрипсина в ряд проб с различным разведением трипсина добавляют известное количество ингибитора трипсина, 35инкубируют смесь и наносят на пластинки. Затем проводят инкубацию вовлажной камере и определяют количество трипсина по степени проявлениязон лизированного желатина. 40П р.и м е р 1. Обработка фотопластинок,Фотографические пластинки (микратСК размером 912 см или пластинкидля ядерных исследований размером 4569 см) засвечивают, проявляют насвету, Фиксируют, тщательно промывают водой, промывают в течение 60 минв этиловом спирте с трехкратной сменой спирта, промывают 60 мин в ацето не с трехкратной его сменой. Полностью высушенную пластинку помещаютна 5 ч в 0,57.-ный раствор дансилхлорида в смеси ацетон - 0,1 М ИаНСО(9 ф 1), затем промывают в течение 5530 мин в ацетоне с трехкратной сменой,. 30 мин в спирте с трехкратнойсменой и в течение 1 ч в воде с шестикратной сменой, затеи высушиваютна воздухе Полученные таким способомготовые к употреблению пластинкиупаковывают змульсионными слоями,друг к другу и хранят (срок храненияприготовленных таким образом пласти"нок составляет не менее шести месяцев).Для получения пластинок с обозначенными полями Фотопластинку экспонируют под сеткой с обозначеннымисветлыми полями размером 5 к 5 мм ичерными линиями толщиной 0,5 мм. Далее Фотопластинку проявляют, фиксируют и модифицируют дансилхлоридом,как описано вьппе, Подготовленные таким образом пластинки с 320 полямимногократно используются для анализов до исчерпания свободных полей.Определение чувствительности пластинок к разным протеолитическим активностям.Пробы ферментов трипсина, химотрипсина, папаина (каждая объемом в10 мкл) в 0,1 М фосфатном буфере, рН7,6, й пепсина в О, 1 М СН,СООН, содержащие О,1; 1,0; 1 О; 100 нг/мклфермента, наносят в виде капли на поверхность подготовленных пластинок ивыдерживают во влажной камере 60 минопри 20 С, промывают в течение 1 минводой, помещают в спиртовой раствор,на 1 мин, затем высушивают 1 мин ивизуалиэируют под ультрафиолетовойлампой. На Фоне интенсивной желтозеленой флуоресценции обнаруживают;черные точки лизиса. Полный лизисвсей толщи желатина, включая основнойнемодифицированный дансилхлоридомслой желатина, наблюдается в точке100 нг/мкл трипсина, Разная степеньлизиса только модифицированного слояжелатина наблюдается в точках 0,110 нг/мкл тричсина; в случае другихферментов лизис наблюдается в точках10-100 нг/мкл. Эти данные свидетельст-вуют о том, что подготовленный опи"санным вьппе способом слой желатинаизбирателен и специфичен к трипсину,но не к другим апробированным Ферментам. При этом максимальная чувствительность пластинок к трипсину составляет 0,1 нг/мкл,П р и м е р 2. Количественное определение активности трипсина и контрикала,В примере представлены данные по титрованию ингибитора трипсина -3 13202 контрикала (СОИТНТСАЬ, УЕВ АК 2 НЕ 1 М 1 ТТЕЮЕКК, РВЕБРЕЯ) трипсином (трипсин кристаллический СПОФА, ЧССР) с активностью, равной 7500 ЕД/мг БАЭЭ, .и раздельно трипсином фирмы КОСН-Ь 1 СНТ 5 ЬАВ ЬТО (Англия, трипсин панкреатический, З-кратнокристаллизированный).В 20 полиэтиленовых ампул (типа Эпендорф) разливают по 100 мкл .0,1 М йа-фосфатного буфера, рН 7,6, содер жащего 5 нг/мкл контрикала. В первые 10 ампул добавляют возрастающие количества (от 10 до 100 мкл) трипсина (СПОФА) в воде в концентрации 10 нг/мкл. В той же последовательности в ампулы 5 добавляют воду (от 100 до 10 мкл) для получения одинакового объема (210 мкл). С остальными 10 ампулами повторяют описанную операцию с той разницей, что используется трипсин фирмы КОСН Ь 1 СНТ. Смесь перемешивают, оставляют при 4 С 60 мин, затем по 10 мкл наносят на пластинку (остальную часть проб хранят при 4 С), выдерживают во влажной камере 330 мин, промывают во дой 1 мин затем спиртом 1 мин, высушивают на воздухе и визуализируют под УФ-излучением. При этом обнаруживается, что в опыте с трипсином СПОФА в пробах 1-7. активность подавлена, а 30 в пробах 8-10 есть лизис. С трипси.ном фирмы КОСН-Ь 1 СНТ активность выражена в пробах .6-10. На этом этапе уже можно грубо оценить как ингибирующую активность контрикала, так и 35 трипсина фирмы КОСН-Ь 1 СНТ. Проведенные расчеты показывают, что актив- ность контрикала находится в пределах 5250-6000 антитрипсиновых ЕД/мг БАЭЭ. Активность трипсина (КОСН-Ь 16 НТ 40 равна 8800-12000 ЕД/мг БАЭЭ. При необходимости повышения точности анализа в зоне титрований 7-8 и 5-6 повторяют опыт. Оставшиеся части пробы 7 (трипсин СПОФА) и пробы 5 (трипсин 45 КОСН-Ь 1 СНТ) делят на 10 частей по 20 мкл, добавляют возрастающие объемы растворов трипсинов (от 1 до 10 мкл, концентрация 1 нг/мкл, трипсин СПОФА- в аликвоты пробы 7, трипсин фирмы КОСН-Ь 1 СНТ " в аликвоты пробы 5) и воды (от 9 до 0 мкл), оставляют при 4 С на 60 мин. По 10 мкл из каждой пробы наносят на пластинку и дальше поступают, как описано выше.В резуль тате обнаруживается, что лиэис имеется в точках 7.3-7.10 и 5.6-5. 10. На основе этих данных можно провести 24 4более точный расчет активностей контрикала и трипсина фирмы КОСН-Ь 1 СНТ (соответственно 5400-5475 антитрипсиновых ЕД/мг БАЭЗ и 9750-9970 ЕД/мг БАЭЭ).П р и м е р 3. Измерение трипсинингибиторного баланса в крови.100 мкл свежеполученной плазмы крови кролика разбавляют в 10 раз в 0,2 М натрийфосфатном буфере, рН 7,6, разливают в 10 полиэтиленовых ампул по 100 мкл. В каждую пробу добавляют возрастающие количества (от 1 до 10 мкл) раствора трипсина в воде (10 нг/мкл) и воду от 9 до 0 мкл, и инкубируют при 4 С 30 мин. Далее по 10 мкл из каждой пробы наносят на пластинку (остальную часть проб хранят при 4 С). Пластинку выдерживают 30 мин во влажной камере, промывают водой 1 мин, спиртом 1 мин, высушивают на воздухе и визуализируют под ультрафиолетом. Обнаруживается, что в пробах 1-6 активность трипсина подавлена, а в пробах 7-10 трипсин проявляет активность. С учетом этих . данных проводят оценку протеинаэноингибиторного равновесия. При необходимости повышения точности анализа в зоне титрования 6-7 повторяют опыт. Оставшуюся часть проб .6 делят на 10 частей по 10 мкл каждая, добавляют по 1 мкл 1 М фосфатного буфера рН 7,6, затем в пробы добавляют возрастающие количества (от 1 до 10 мкл) раствора трипсина (1 нг/мкл) и от 9 до 0 мкл воды, инкубируют 30 мин при 4 С, по 10 мкл от каждой пробы наносят на пластинку, выдерживают 30 мин, промывают водой, спиртом, сушат и визуализируют под ультрафиолетом.Формула изобретения1.Способ определения активности трипсина путем нанесения пробы на . фиксированную и высушенную поверхность желатинового слоя фотопластины, инкубации во влажной камере, промывания водой с последующим визуальным определением наличия активности по участкам лизированного желатина, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения и повышения чувствительности способа, фотопластину предварительно засвечивают, перед фиксацией фотопластину проявляют, за" тем Обрабатывают раствором дансилСоставитель Н, ГуляеваТехред И.Попович Редактор И. Рыбченко Корректор Л, Пилипенко Заказ 2612/22 Тираж 499 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/Подписное Производственно-полиграфическое лредлриятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 5 1320224 6хлорида в смеси ацетон - бикарбонат- чественного определения трипсина, в ный буфер 9;1, последовательно промы- ряд проб с различным разведением веют в ацетоне, спирте воде и высу- трипсина добавляют известное колишивают, а наличие участков лизирован- чество ингибитора трипсина, смесь ного желатина определяют в ультра инкубируют наносят на пласфиолете в виде темных пятен на фоне тинки, а количество трипсижелто-зеленой флюоресценции. на определяют по степени2, Способ по п. 1, о т л и ч а - проявления зон лизированного ю щ и й с я тем, что, с целью коли- желатина,