Способ иммунодиагностики инфекции

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ 1789927 А РЕСП ГОСУДАРСТВЕННОЕВЕДОМСТВО ССС)ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРС СВИДЕТЕЛЬСТ пробы крови больного: при различном времени экспозиции с объектами фагоцитоза или при одном времени экспозиции, но с добавлением в одну из проб крови растворимой специфической субстанции микробов и рассчитывают величину отношения фагоцитоза двух объектов (индекс) по формулеИндекс= Величина соотношения специфического и неспецифического объектов в пробе с добавлением растворимой микробной субстанции (с большей экспозицией)/Величина соотношения фагоцитоза специфического и неспецифического объектов в пробе беэ добавления растворимой микробной субстанции (с меньшей экспозицией) и при величине атно- Я шения меньше 0,75 диагностируют инфекцию, 3 табл. рольных лйц, Достоверным с величины соотношения более нее 0,66.Недостаток укаэанного сп чается в необходимости прове нительного исследования у лиц и в недостаточной точнос с тем; что в качестве контро пользуются здоровые лица с нями ФАЛ, что определяет дополнительной погрешнос ния фагоцитоза. В частност абсолютном уровне ФАЛ у ко погрешность метода возраст вие этого невозможно досто лить специфический сдвиг фагоцитоза при изменении в ношения фагоцитоза двух обь итают сдвиг 1,50 или меособа закл дения допо(71) Пермский государственный медицинский институт(56) Авторское свидетельство СССРМ 1627992, кл. 6 01 й 33/53, 1989.(54) СПОСОБ ИММУНОДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ(57) Использование: изобретение относитсяк медицине и может быть использовано дляиммунодиагностики инфекций. Цель: повышение точности и уменьшение трудоемкости способа. Сущность изобретения;указанная цель достигается тем, что диагностическое исследование производят толькос кровью больного, при этом исследуют 2 1.Изобретение отйосится к медицине и может быть использовано для иммунодиагностики инфекций,Известен способ иммунодиагностики путем одновременного определения фагоцитарной активности лейкоцитов (ФАЛ) крови больного и контрольных лиц с использованием в качестве объектов фагоцитоза эритроцитов йз специфического и неспецифического. эритроцитарных диагностикумов, По этому способу исследуют ФАЛ со смесью специфических и неспецифических объектов фагоцитоза. и производят сопряженный учет фагоцитоза обоих объектов, Специфические изменения ФАЛ больного определяют по соотношению уровней специфического и неспецифического обьектов в сопоставлении с их соотношением у контконтрольных ти, связанной льных лиц исразными уров- возможность ти исследоваи, при низком нтрольныхлиц ает. Вследстверно опредесоотношения елйчины соотектов меньше, 1789927чем в 1,5 раза в сравнении с контролем тельного исследования фагоцитоза конт- (индекс меньше 0,67 или более 1,5 раза), рольных лиц, а наличие специфических изКроме того, у больного возможны различ- менений ФАЛ определяют по изменению ные изменения крови, что ведет к различно- соотношения уровней фагоцитоза специфиму окрашиванию мазка крови у больных и 5 ческого и неспецифического объектов.при контрольных лиц. У больного и контрольных - "различном времени экспозиции смеси кролиц должна быть одинаковая экспозиция ви больного собъектамифагоцитоза, или до крови с объектами фагоцитоза и модуляции и после дополнительного контакта крови времени не допустимы. больного с растворимой специфическойЦель изобретения - повышение точно- "О микробнойсубстанцией(способнойнавести сти и уменьшение трудоемкостй способа, специфическую реакцию крови контрольУказаннаяцельдостигаетсятем,чтоди- ных лиц), тогда как в известном способе агностическое исследование производят необходимо дополнительное исследование только с кровью больного, при этом иссле- ФАЛ у контрольных лиц,дуют 2 пробы крови больного при различ Способосуществляютследующимобраном времени экспозиции с объектами зом. Исследование ФАЛ производят с равфагоцитоза или при одном времени экспо- ной смесью 1;6-ных взвесей специфических эиции, но с добавлением в одну из проб инеспецифическихэритроцитов; В качестве кроаирастворимойспецифическойсубстан- специфического объекта используют ции микробов и рассчитывают величину от-,20 предварительно окрашенную голубым ношения фагоцитоза двух объектов (индекс) анилиновым красителем 1 ф 6-ную взвесь анпо формуле- тигенного эритроцитарного диагности)сума.Индекс= Величина соотношения для РПГА или фиксированный на эритроциспецифического и неспецифического объек- те сложный комплекс антиген-антитело-спетов в пробе с добавлением растворимой 25 цифический микробный поли- или микробной субстанции (с большей липополисахарид. С целью микроскоэкспозицией)/Величинасоотношенияфаго- пического различения от эритроцитов, цитоза специфического и неспецйфи- . содержащих специфический антиген, неческого объектов в пробе без добавления специфические эритроциты также заранее раствормой микробной субстанции (с мень- ЗО окрашивают анилиновым красителем бордо шей экспозицией) и при величине отноше- или черным и готовят 1-ную взвесь эритния меньше 0,75 диагностируют инфек- роцитов, В качестве растворимой специфицию, . ческой микробной субстанции используютОснованием к применению этого спосо- элюировавшую в физраствор с эритроциба служат два момента. Первый момент за- З 5 тарного диагностикума специфическую расключается в том, что у здоровых лиц или лиц, творимую микробную субстанцию (суперлиц) не имеющих специфической реакции, при или вакцину в разведении 10 -10 (также различном времени экспозиции крови со способную наводить специфическую реаксмесью двух обьектов происходит пропор- . цию клеток крови контрольных лиц).циональное увеличение их фагоцитоза, а 40 Проколом пальца больного набирают при наличии специфической реакции соот- . 0,1 мл крови и смешивают с 0,1 мл раствора ношение уровней фагоцитоза специфиче-Глюгицира" (или другого антикоагулянта) ского и неспецифического объектов во избежание свертывания крови. Концентменяется в зависимости от временй экспо-рируют лейкоциты, производя центрифугиэиции, Второй момент связан с возможно рование в течение 10 мин при 500 об/мин и стью наведения ин витра специфического основную массу плазмы с консервантом повышения ФАЛ прй воздействии специфи-удаляют, затем кровь тщательно перемешической растворимой микробной субстанции вают.на кровь контрольных лиц и лиц, не имев- Применяют 2 варианта постановки рещих специфического процесса, тогда как у 50,акции,больных со специфической инфекцией про-В йервом варианте при определении является подавляющее действие этой суб- специфической реакции в зависимости от станции на фагоцитоз специфического времениэкспозициикровьбольноговобъеобъекта, что также можно выявить по измене- ме 10 мкл вносят в пробирку и добавляют 10 нию соотношенйя уровней фагоцитоза специ мкл равной смеси однократно отмытых физфического и неспецифического объектов. раствором 1 фб-ных взвесей специфическогоОтличие заявляемого способа от изве- (голубого цвета) и неспецифического(черностного заключается в том, что в заявляемом го цвета) обьектов фагоцитоза, После тщаспособе определение фагоцитоза произво- тельного перемешивания пробирку дят только с кровью больного без дополни- помещают в термостат при температуре37(; при периодическом встряхивании. Готовят мазки в виде узких ровных мазков на одном предметном стекле в поперечном направлении с помощью Устройства для изготовления мазков, либо обычным способом - один мазок на одном предметном стекле через 5-10 мин (меньшая экспозиция) и 20- 30 мин (большая экспозиция),Во втором варианте, осуществляемом путем дополнительного воздействия на кровь растворимой специфической субстанции, кровь больного в объеме по 10 мкл вносят в две пробирки. В первую (контрольную) вносят 5 мкл физраствора, а во вторую - 5 мкл растворимой специфической микробной субстанции и после тщательного перемешивания обе пробы помещают в термастат при 37 С на 20 мин, Затем в обе пробы добавляют по 10 мкл равной смеси специфического и неспецифического диагностикумов, тщательно перемешивают и вновь помещают в термастат на 10 мин при периодическом встряхивании, После этого готовят мазки из обеих проб одномоментно на предметном стекле. Мазки высушивают, фиксируют и окрашивают по Романовскаму-Гимзе. При этой окраске неспецифические эритроциты приобретают черный цвет и хорошо отличаются от специфических, которые окрашиваются в синий цвет. Под иммерсианным обьективом определяют фагоцитарную способность 100 нейтрофилов. Фагацитоз учитывают только в изолированно лежащих лейкоцитах, избегая подсчета в конгломератах клеток. В каждой клетке учитывают количество фагоцитиро. ванных специфических (синега цвета) и неспецифических (черного цвета) объектов.Затем вычисляют среднее число фагоцитированных специфических и неспецифических зритроцитов на лейкоцит (фагоцитарное число), Изменения фагоцитоза специфического и неспецифического объектов при меньшей экспозиции принимают за 100% и выражают в процентах к ним показатели пробы при большей экспозиции, По. казатели пробы без воздействия специфической микробной субстанции также принимают за 1000 и выражают в процентахк ним показатели пробы после . воздействия специфической растворимой , микробной субстанции, Полученную от делений величину обозначают как индекс специфического сдвига фагоцитоза (ИСФ).Диагностически значимым признают понижение величины индекса ниже 0,75. Повы- шение индекса выше этой величины указывает на отсутствие указанной инфекции.35 лена у 57 человек (83,8 ) и у 11 (16,2 ) 40 45 отметить, что 11 из этих детей поступили с подозрением на корь, однако диагноз был 50 .впоследствии снят. 55 5 10 15 20 25 30(Пример осуществления способа при диагностике кори,В качестве специфического объекта фагоцитоза использовали 1 -ную взвесь зритроцитарного антигенного сухого коревого диагностикума для РПГА производства Ленинградского НИИЭМ им. Пастера. В качестве неспецифических использовали 1%-ную взвесь гриппозных антигенных эритроцитов типа А для РН ГА производства Одесского предприятия по производству бактерийных препаратов,Для диагностики использовали применение варианта определения специфической реакции путем воздействия на кровь больного растворимой специфической микробной субстанции - супернатанта,Поданным исследования в контрольной пробе (с физраствором) фагоцитарное число в отношении специфического объекта составило 0,28, а в отношении неспецифического -0,36. В пробе после воздействия растворимой специфической субстанции (супернатанта коревого диагностикума) показатели составили 0,09 (320 ) и 0,25 (69) соответст 32 4венно, ИСФ= - =0,46,69%Заключение: У больного имеется коревая инфекция.Всего было обследовано 68 больных корью в различные сроки заболевания (от периода инкубации до 6-8 дня высыпания), Из них при применении известного способа положительная реакция на корь была выявреакция не выявилась. Однако при обследовании этих 11 детей по заявляемому способу еще у 5 больных была выявлена положительная реакция на корь, что в сумме составило уже 62 из 68. Таким образом, диагностически значимый результатбыл выявлен у 91,20 больных.С целью дифференциальной диагностики исследование было проведено у 20 больных с краснухой и с аллергическими реакциями кожи. У всех этих больных реакция на корь была отрицательной. Следует Пример осуществления заявляемого способа при диагностике гриппа.В качестве специфического объекта фагоцитоза использовали 10 -ную взвесь гриппозных антигенных эритрацитов типа А для РКГА производства Одесского предприятия по производству бэктерийных препаратов, в качестве контрольных - 1%-ную взвесь эритроцитов сухого коревого анти 1789927генного диагностикума для РПГА производства Ленинградского НИИЭМ им. Пастера.Для диагностики испольэовали применение варианта определения специфической реакции путем воздействия на кровь 5больного растворимой специфической микробной субстанции - супернатана специфического диагностикума,Поданным исследования в контрольнойпробе(с физраствором) фагоцитарное число 10в отношении специфического обьекта составило 0,15, а в отношении неспецифического - 0,10. В пробе после воздействия.растворимой специфической субстанции(супернатана) показатели фагоцитоза специфического объекта составили 0,07(47 о ) инеспецифического - 0,10 (100 о ), ИСФ=47 о- 1 ОО о - 0,47,Заключение: у больного имеется гриппозная инфекция.Всего было обследовано 170 больных сподозрением на грипп, По известному способу специфическая реакция была выявленау 134 (78,8%). При обследовании по заявляемому способу у 20 из оставшихся Зб человек были выявлены специфические длягриппа изменения ФАЛ и таким образомдиагностически значимый результат былвыявлен у 154 из 170 больных (90,6 о ). 30С целью дифференциальной диагностики исследование было произведено у 36 детей, поступивших с подозрением наэнтеровирусную инфекцию. Ни у одного изних специфических для гриппа изменений 35ФАЛ выявить не удалось.Пример осуществления заявляемогоспособа при диагностике дизентерии Зон- .не.В качестве специфического объекта фагоцитоэа использовали 1 о -ную взвесь ан-тигенного эритроцитарного сухогодиагностикума для РНГА из шигелл Зоннепроизводства Ленинградского НИИ вакцини сывороток, а в качестве неспецифических - 451-ную взвесь антигенного эритроцитарного сухого дизентерийного диагностикума изшигелл Флекснер того же НИИ вакцин исывороток,Наличие специфической реакции определяли при различных сроках экспозиции.Пробы крови больного смешивали с равнымобъемом 1%-них взвесей двух обьектов фагоцитоза и готовили мазки после 5 и 20-минутной экспозиции. 55Па данным исследования при меньшейэкспозиции фагоцитарное число в отноше.нии специфического обьекта составило0,42, а в отношении неспецифического -0,25, В пробе при большей экспозиции по-казатели фагоцитоэа специфического обьекта составили 0,51 (121 ) и 0,55 (220 )неспецифического соответственно, Индекс ==0,55.121 о220 %Заключение: у больного имеется дизентерия Зонне, Бактериальное подтверждение было получено значительно позднее.Учитывая, что основным методом диагностики таких вирусных заболеваний, каккорь и грипп, является серологическое обследование, результаты которого имеютлишь ретроспективное (исследование титров антител в парных сыворотках на 10-12день от начала заболевания), а заявляемыйспособ иммунодиагностики позволяет уточнить диагноз заболевания в день исследования, прост. нетрудоемок и не требуетспециального оборудования, он может бытьиспользОвай как для диагностики указанных заболеваний, так и для их дифференциальной диагностики от сходных с ним поклиническим признакам заболеваний,Заявляемый способ более точен, так какпри исследовании ФАЛ одного и того желица в дйнамике наблюдаются гораздо менее выраженные колебания соотношенияфагоцитоза специфического и неспецифического объектов и соответственно меньше вариации величины ИСФ, чем приодновременном исследовании ФАЛ у различных лиц, что подтверждается данными,приведенными в табл.1:Очевидно, что колебания соотношенийфагоцитоза у различных лиц при одной экспозиции более выражены, чем вариации уодного и того же лица при разном времениэкспозиции.Заявляемый способ менее трудоемок(на одну треть как минимум), поскольку для .уточнения диагноза требуется исследование двух мазков, в отличие от известногоспособа, где необходимо исследование какминимум трех мазков(один мазок больногои два у контрольных лиц для вычислениясредних величин уровней фагоцитоза.Вариации величины соотношения фагоцитоза двух обьектов в серии проб кровиодного обследованного донора (А) пред- .ставлены в табл. 2.Вариации величины соотношения фагоцитоза двух обьектов в серии параллельныхпроб крови группы обследованных (Б) представлены в табл. 3,Большая точность определения ИСФпри исследовании проб крови одного человека в сравнении с определением ИСФ впробах различных здоровых людей доказывают данные вариации величины ЙСФ вэтих исследованиях, В серии исследований10 1789927 10 Таблица 1 Вариации соотношения уровней фагоцитоза специфического (в числителе) и неспецифического (в знаменателе) объектов при различной экспозиции и при сопоставлении проб двух доноровТаблица 97 проб человека (А) вариации величины ИСФ были в пределах 0,84-1,18 и коэффициент вариации величины ИСФ составил 12,0, При определении ИСФ в серии проб крови 8 здоровых людей (Б) вариации ИСФ были в пределах 0,74-1,31 и коэффициент вариации величины ИСФ составил 17,8. СоответстФормула изобретения Способ иммунодиагностики инфекций путем определения фагоцитарной активности лейкоцитов крови больного при инкубации ее со специфическим и неспецифическим объектами фагоцитоза с оценкой результатов реакции по величине индекса специфического изменения фагоцитоза, определяемого по соотношению уровней фагоцитоза двух объектов у больного в сопоставлении с их соотношением у донора, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с венно этому диапазон колебаний величины ИСФ в заявляемом способе меньше и диагностическим значением в заявляемом, способе является изменение величины ИСФ 5 при соотношении показателей фагоцитозадвух объектов меньше 0,75. целью повышения точности способа, исследование фагоцитарной активности со специфическим и неспецифическим объектами 15 ведут в пробах крови больного при другомзначении времени инкубации или при таком же значении времени с добаеленивм растворимой субстанции микробов, далве рассчитывают индекс специФического ие менения фагоцитоза по величинам соотно-шения фагоцитоэа двух объектов во второй пробе к первой и при значении индекса меньше 0,75 диагностируют инфекцию,1789927 Таблица 3 Составитель В.КаплинТехред М.Моргентал: Корректор А.Моталь дактор А.Мельнико зводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101Заказ 347 Тираж . ,. ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5