Способ определения эффективности гемосорбции

(э)э 6 01 М ЗЗ/4 НИЕ ИЗОБРЕ ЕН И К АВТО БССР и Гроднен ицинский инстиЧайковродно иматол анест в: 198 КТИВ ульфат ы воз- спектробы с после шении ульфат ны возплазма крови:перекись водорода:с меди, равном 1;800:5, при длине вол буждающего света 330 нм; на фиг.З - ры флуоресценции анализируемой и плазмой крови больного, взятой до и гемосорбции при молярном соотно плазма крови: перекись водорода: с меди, равном 1:3000:5, при длине вол буждэющего света 330 нм,Способ осуществляется следую щим образом,Производят забор крови у больного до и после гемосорбции и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин, отделяют плазму. Отэделенную плазму крови (концентрация 10 М), взятую до и после гемосовбции, помещают в четыре пробирки по 100 мкл. 8 первые две пробирки к плазме крови, взятой до и после гемосорбции, добавляют перекись водорода и соль двухвэлентной меди при молярном соотношении плазма ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭффНОСТИ ГЕМОСОРБЦИИ Изобретение относится к биохимии и медицине, касается определения снижения уровня эндогенной интоксикации при проведении гемосорбции и может быть использовано при проведении биохимических анализов в лабораторной медицинской практике при определении степени интоксикации после проведения детоксикационной терапии,Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности способа,На фиг.1 показаны спектры флуоресценции анализируемой пробы с плазмой крови больного, взятой до и после гемосорбции при молярном соотношении плазмы крови: перекись водорода: сульфат меди, равном 1:400:5, при длине волны возбуждающего света 330 нм; на фиг,2 - спектры флуоресценции анализируемой пробы с плазмой крови больного, взятой до и после гемосорбции при молярном соотношении(57) Изобретение относится к медицине. аименно к биохимии. Цель изобретения - повышение точности способа. Цель достигается за.счет того, что в анализируемую пробу добавляют перекись водорода и соль двухвалентной меди, разбавляют плазму, проводят флуориметрическое исследование контрольной и анализируемой пробы, находят показатель соотношения интенсивности флуоресценции анализируемой и контрольной проб и при динамическом снижении показателя в пробе,.взятой после гемосорбции, по сравнению с пробой до гемосорбции считают процедуру эффективной. 3 ил.крови: перекись водорода: соль двухвалентной меди, равном 1:4003000:5, а во вторые две пробирки с плазмой крови, взятой до и после гемосорбции (контроль) добавки перекиси водорода и соли двухвалентной меди не производят. Затем все четыре пробирки с пробами плазмы крови ставят на инкубацию в водяную баню при 37 С. После . 30-минутной инкубации пробы, включая иконтрольные, разбавляют до концентрации белков в плазме крови, равной 10 М, т,е, в 1000 раз, добавляя 100 мл 0,05 М натрийфосфатного буфера, рН 7, Разбавление пробы позволяет уменьшить обьем используемой для анализа плазмы, обеспечивая при этом точное измерение последующей интенсивности флуоресценции, работая с низкой концентрацией плазмы крови (до 10 М), Затем измеряют интенсивность флубресценции проб на длине волны 390-410 нм при длине волны возбуждающего света 325 - 335 нм, Оценку снижения уровня эндогенной интоксикации делают,по интенсивности флуоресценции, сравнивая результаты измерения флуоресценции анализируемой пробы с плазмой крови, взятой до и после гемосорбции.В предлагаемом способе определенияснижения уровня эндогенной интоксикации при проведении гемосорбции на этапе отработки оптимальных его параметров было установлено, что наилучший эффект от использования заявляемого способа регистрировался при добавлении к плазме крови перекиси водорода и соли двухвалентной меди в молярном соотношении плазма крови:перекисьводорода:сольдвухвалентной меди, равном 1:400.3000;5 при концентрации пробы плазмы крови 10 - 10 М и при измерении интенсивности флуоресценции на длине волны регистрации 390 в 4 нм, при длине волны возбуждающего света 325- 335 нм, Высший предел концентрации белков в плазме крови (10 М) обусловлен их естественной концентрацией, а нижний предел концентрации (10 М) - зоной чувст-ввительности способа.Избытки перекиси водорода меньше400-кратного по отношению к белку плазмы в присутствии соли двухвалентной меди и плазмы крови не приводят к эффекту возгорания флуоресценции. А избытки перекйси водорода больше 3000-кратного по отношению к белку плазмы в присутствии соли двухвалентной меди и плазмы крови приводят к денатурации белков плазмы. Возгорание флуоресценции белков плазмы в присутствии перекиси водорода и 5-кратного избытка соли двухвалентной меди на 400 нм (Меозв, 330 нм) максимально, При избытках соли двухвалентной меди менее 5-кратного эффект возгорания флуоресценции менее значителен (в присутствии перекисиводорода), А при избытках соли двухвалент 5 ной меди более, чем 5-кратные в комплексес перекисью водорода наблюдается деструкция белка,Измерение флуоресценции на длиневолны ниже 390 нм при длине волны возбуж 10 дающего света ниже 325 нм ведет к недостаточной интенсивности свечения, аизмерение флуоресценции на длине волнывыше 410 нм при длине волны возбуждающего света 335 нм не приводит к увеличе 15 нию интенсивности свечения.Ввиду того, что интервал длин волн регистрации и возбуждающего света невелики возможность проведения измерения интенсивности флуоресценции при его гра 20 ничных значениях очевидна, авторыприводят все три примера осуществленияспособа с наиболее .оптимальными параметрами длины волны регистрации и длиныволны возбуждающего света, а именно: дли 25 на волны регистрации - 400 нм, а длйнаволны возбуждающего света - 330 нм.Примеры, подтверждающие воэможность осуществления изобретения с получе- .нием положительного эффекта приЗО использовании всей совокупности существенных признаков изобретения, указаннойв его формуле,П р и м е р 1. Больная С., 53 года, мед.карта М 3276 поступила на стационарное ле 35 чение в Гродненскую областную клиническуюбольницу 24.02.88 г. с диагнозом: Состояниепосле аппендэктомии. Перитонит. Сепсис.После клинико-лабораторных исследований б-ной С, с целью детоксикации орга 40 низма был проведен сеанс гемосорбции.Снижение уровня эндогенной интоксикации при проведении гемосорбции у больнойопределяли путем сравнения значения отношений интенсивности флуоресценции45 анализируемой и контрольной проб с плазмой крови, взятой до и после гемосорбции.Для этого у больной до проведения гемосорбции и последнее будет кровь (по 500 мкл).Отделяют плазму центрифугированием при50 3000 об/мин в течение 15 мин, Отделеннуюплазму (концентрация 10М) помещают вчетыре пробирки по 100 мкл в каждую. Впервые две пробирки с плазмой крови больной (по 100 мкл, концентрация 10 М), пол 55 ученной до и после гемосорбции добавляют5 мкл перекиси водорода, исходная концен. трация 7,94 М, что соответствует моля рномусоотношению плазма крови; перекись водоРода: сульфат меди, равному 1:400;5, Вовторые две пробирки с плазмой крови боль 1818586ной (по 100 мкл, концентрация 10 М), полученной до и после гемосорбции (контроль)добавки перекиси водорода и сульфата меди не производят. Затем все четыре пробирки с пробами плазмы крови ставят на 5инкубацию в водяную баню при 37 фС. Через30 мин инкубации ко всем пробам добавляют по 100 мл натрий-сульфатного буфера,концемтрацией 0,05 М. рН 7, разбавляя таким образом пробу в 1000 раз и получая при 10этом концентрацию белков плазмы крови впробе, равную 10 М, что позволяет уменьшить количество используемой для анализаплазмы, После разбавления проб прописываютт спектры флуоресценции при длине 1волны возбуждающего света 330 нм.Кривой 1 на фиг.1 показам спектр флу.оресценции контрольной пробы с плазмойкрови больмого, взятой до гемосорбции, акривой -спектрфлуоресцемцииконтрольиной пробы с плазмой крови того же больного, взятой после гемосорбции, Кривой 2 нэфиг.1 показан спектр флуоресценции анализируемой пробы с плазмой крови больного,взятой до гемосорбции при молярном соотношении плазма крови: перекись водорода: сульфат меди, равном 1:400:5, Кривой 2спектр флуоресценции анализируемой пробы с плазмой крови того же больного, взя-той после гемосорбции при молярном 30соотношении плазма крови: перекись водорода: сульфат меди, равном 1:400:5, Каквидно из фигуры 1, по сравнение с контрольнымм пробами(кривыеи 1 ) в пробах,к которым добавляли перекиг(ь водорода и 3сульфат меди (кривые 2 и 2 ), наблюдаютувеличение интенсивности флуоресценцммпроб. Для определения снижения уровняинтоксикации у больной С. при проведениигемосорбции находят по спектрам флуоресценции на фиг.1 отношения значений интенсивности флуоресценции (в относительныхединицах) анализируемой пробы к контрольной, с плазмой крови больной, взятой до ипосле проведения гемосорбции, при этом используют длину волны возбуждения 330 нм, арегистрацию ведут на максимуме флуоресценции - 400 нм. Значение интенсивности флуоресценции (кривая 2 фиг.1) анализируемойпробы с плазмой крови больной С взятой 50до гемосорбции, равно 23,5 отн.еда значе.ние интенсивности флуоресценции (кривая1 фиг.1) контрольной пробы с плазмой крови той же больной Свзятой также до гемосорбции, равно 5 отн.ед, Отношение 55найденных значений интенсивности флуоресценции анализируемой пробы к контрольной, с плазмой крови взятой догемосорбции, равно -= 4,7,23,55 Аналогичным образом находят значение интенсивности флуоресценции аналмзируемой пробы и контрольной с плазмой крови, взятой у той же больмой С. после проведения гемосорбции. Для аналмзирувмой пробы (кривая 2 фиг.) зто значение равно 4,8 отн.вд., а для контрольмой(кривая 1фиг.1) - 4,2 отн.ед Отсюда отношение найденных значений интенсивности флуо-, ресценции анализируемой пробы и контрольной с плазмой крови, взятой у 6-ной С. после гемосорбции, равно 4 р;-1,14. По раз 4,8ностИ значений отношений (4.70-1,14) 3,56) интенсивности флуоресцемцми анализируемой пробы и контрольной с плазмой крови, взятой у больной до и после проведвммя гемосорбции, судят е снижении уровня мнтоксикацми при проведении гемосорбции.П ри м е р 2. больной Г., 9 лет, мед.кэрта М 6541 поступил на стационарное лечение в Гродненскую областную клмммческую больницу 14,04;88 г с диагнозом: Двуксторомняя пневмония. Седок. Токсическая энцефалоп эти я,После клинико-лабораторных исследований больному Г, с целью детоксикации организма был проведем сеанс гемосорбции. Снижение уровня зндогемной интоксикации при проведении гемосорбции у больного определяли путем сравнения значений интенсивности флуоресценцми анализируемой и контрольной проб с плазмой крови, взятой до м после гемосорбции, Забор крови осуществлялм аналогично, как описано в примере 1. Полученную плазму помещают.в четыре пробирки по 100 мкл. В первые две пробирки с плазмой крови больного Г. (по 100 мкл концентрация 10 З М), получений до м по 6 ле гемосорбции добавляют 10 мкл перекиси водорода, исходная концентрация 7,94 М и 50 мкл сульфата меди, исходная концентрация 1 О М, что соответствует молярному соотношению плазма крови: перекись водорода: сульфат меди, равному 1;800:5, Во вторые две пробирки с плазмой крови больного(по 100 мкл концентрация 10М), полученной до и после гемосорбции (контроль), добавки перекиси водорода и сульфата меди не производят, Последующую инкубацию и разбавление проб производят аналогично, как описано в примере 1, После разбавления проб прописывают спектры их флуоресценции при длине волны возбуждающего света 330 нм.Кривой 1 на фиг,2 показан спектр флуоресценции контрольной пробы с плазмой крови больного Г., взятой до гемосорбции, а кривой 1 - спектр флуоресценции конт 11рольной пробы с плазмой крови того же мой и контрольной проб с плазмой крови,больного, взятой после гемосорбции, Кри- взятой до и после гемосорбции.вой 2 на фиг,2 показан спектр флуоресценЗабор крови осуществлялся аналогичции анализируемой пробы с плазмой крови . но. как описано в примере 1. Полученнуюбольного, взятой до гемосорбции при мо плаэмупомещаютвчетыре пробирки по 100лярном соотношении плазма крови: перв- мкл. 8 первые две пробирки с плазмой крокись водородасульфат меди, равном ви больного Б. (по 100 мкл, концентрация1:800:5, Кривой 2 - спектр флуоресценции 10 М), полученной до и после гемосорбции,. аналиэируемойпробысплазмойкровитого добавляют 38 мкл перекиси водорода, исже больного, взятой после гемосорбции при 10 ходная концентрация 7,94 М и 50 мкл сульмолярном соотношении плазма крови: пе- фата меди, исходная концентрация 10 М,рекись водорода: сульфат меди, равном чтосоответствуетмолярномусоотношению1:800:5. Значение интенсивности флуорес- плазма крови; перекись водорода: сульфатценции (кривая 2 фиг,2) анализируемоймеди, равному 1:3000:5. Во вторые две пропробы с плазмой крови больного Г., вэятрй 15 бирки с плазмой кзоови больного(по 100 мкл,до гемосорбции,равно 26,5 отн,ед.,азначеконцентрация 10 М), полученной до и поние интенсивности флуоресценции (кривая сле гемосорбции (контроль), добавки пере 1 фиг.2)контрольнойпробысплазмойкро- киси водорода и сульфата меди неви того же больного Гвзятой также до производят, Последующие инкубацию игемосорбции, равно 6,4 отн.ед. Отношение 20 разбавление проб производят аналогично,найденных значений интенсивности флуо- как описано в примере 1, После раэбавлересценции анализируемой пробы к конт- ния проб прописывают спектры их флуоресрольной с плазмой крови, взятой до ценции при длине волны возбуждающегогемосо б ии авно 2- 414 света ЗЗОнм,6,4 25 Кривой 1 на фиг,З показан спектр флуАналогичным образом находят значе-. оресценции контрольной пробы с плазмойния интенсивности флуоресценции анэли- крови больного, взятой до гемосорбции, азируемой пробы.и контрольной с плазмой кривой 1 - спектр флуоресценции конт- .икрови, взятой у того же больного Г. после рольной пробы с плазмой крови того жепроведения гемосорбции. Для анализируе- ЗО больного, взятой после гемосорбции. Кримой пробы (кривая 2 фиг;2) это значение вой 2 на фиг,З показан спектр флуоресценравно 12,5 отн.ед., а для контрольной (кри- ции анализируемой пробы с плазмой кровивая,1 фиг.2 - 6 отн.ед. Отсюда, отношение больного, взятой до гемосорбции при монайденных значений интенсивности флуо- лярном соотношении плазма крови: перересценции анализируемой пробы и конт кись водорода: сульфат меди, равномрольной с плазмой крови, взятой у больного, .1 3000:5. Кривой 2 - спектр флуоресценцииИГ и с ге б а о 125 2 08 П анализируемой пробы с плазмой крови того6.жебольного,взятой послегемосорбцииприразности значений отношений (4,14-2,08" молярном соотношении плазма крови; пе,06) интенсивности флуоресценции анали рекись водорода: сульфат меди, равномзируемой пробы и контрольной с плазмой 1:3000:5, Значение интенсивности флуорескрови, взятой у больного до и после прове- ценции (кривая 2 фиг,З) анализируемойдения гемосорбции судят о снижении уров- пробы с плазмой крови больного Б., взятойня. интоксикации при проведении до гемосорбции, равно 22 отн,ед., а эначегемосорбции. 45 ние интенсивности флуоресценции (криваяП р и м е р 3. Больной Б., 60 лет, мед, 1 фиг,З) контрольной пробы с плазмой крокарта М 5074 поступил на стационарное ви того же больного Б взятой также долечение Гродненской области клинической гемосорбции, равно 7,5 отн.ед. Отношениебольницы 22.03.88 г с диагнозом: Ревма- найденных значений интенсивности флуотизм, акт, Н. Септический эндокардит. Аор ресценции анализируемой пробы к конттальномитральный порок сердца. рольной с плазмой крови, взятой доПравосторонняя пневмония, Острая почеч/ гемосорбции, равно - = 2,93.ная недостаточность. 7,5После клинико-лабораторных исследо- Аналогичным образом находят значеваний был проведен сеанс гемосорбции, 55 ния интенсивности флуоресценции аналиСнижение уровня эндогенной интоксика- зируемой пробы и контрольной с плазмойции при проведении гемосорбции у больно-,крови, взятой у того же больного Б, послего определяли путем сравнения значений проведения гемосорбции. Для анализируеинтенсивности флуоресценции анализируе- мой пробы (кривая 2 фиг,3) это значениеравно 18,0 отн.ед., а для контрольной (кри1818586 10 ЗО 0 вая 1 фиг.3) - 6.5 отн,ед., э отсюда отношеПние найденных значений интенсивности флуоресценции анализируемой пробы и контрольной с плазмой крови; взятой у больного Б. после гемосорбции, равно - 2,77. По разности значений отношений 186,5(2.93-2,77-0,16) интенсивности флуоресценции анализируемой пробы и контрольной с плазмой крови, взятой у больного до и послегемосорбции, судят о снижении уровня интоксикации при проведении гемосорбции.Существенно, что добавление к плазме крови больного только одного из действующих реагентов- перекиси водорода или сульфата меди в указанных примерах молярных соотношений, не влияет иа интенсивность флуоресценции в первом случае, а во втором - ведет к незначительным изменениям интенсивности флуоресценции, затрудняя проиавести оценку снижения уровня интоксикации при проведении гемосорбции.Предлагаемый способ позволяет, по сравнению с известным, сйизить исходную концентрацию плазмы крови в анализируемой прббе до 10 М (в прототипе используется плазма крови с концентрацией 10 з М), при этом обеспечивается необходимая и достаточная для регистрации интенсивность флуоресценции анализируемой пробы при возбуждении флуоресценции светом с длиной волны 325 - 355 нм нэ длине волны регистрации 390 - 410 нм, что свидетельствует о повышении чувствительности определения уровня интоксикации более, чем на 2 порядка. Снижение концентрации плазмы кровиЭ в анализируемой пробе позволяет .уменьшить количество используемой для анализаплазмы,Повышение специфичности предлагае 5 мого способа по сравнению с известнымдостигается за счет использования в качестве добавляемых реагентов к плазме кровиперекиси водорода и соли двухвалентноймеди с последующим определением уровня,10 интоксикации в относительных единицах поинтенсивности флуоресценции на длиневолны 390 - 410 нм при длине волны возбуж. дающего света 325-335 нм,еФ15 . Формула изобретенияСпособ определения эффективности гемосорбции, включающий забор крови до ипосле проведения гемосорбции, выделение .плазмы центрифугированием с последую 20 щим спектрофотометрическим исследованием анализируемой и контрольной пробы,о т л и.ч а ю щ и й с.я тем. что, с цельюповышения точности способа, после выделения плазмы в анализируемую пробу до 25 бавляют перекись водорода и сольдвухвалемтной меди при молярном соотношении 1;400-3000:5, разбавляют плазму в10-1000. раз, проводят флуориметрическоеисследование контрольной и анализируе 30 мой проб при длине волны 390-410 нм, находят показатель соотношейияинтенсивности флуоресцемции анализируемой и контрольной проб и при динамическом снижении показателя в пробе, взятой35 после гемосорбции, по сравмению с пробойдо гемосорбции считают процедуру эффективной..Король Заказ 1936 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям113035. Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 ри ГКНТ С изводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 10