Способ получения анатоксина

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИРЕСПУБЛИК 19) (И) ИЙ с Ф. .Я ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ АТЕНТУ 4(21) (22) 235495/23.01.8127825/802,09.80 гически активных веществ. Цель изобретеснижение токсичности целевого проза счет модификации метода выдеи детоксикации, Иэ культуральидкости после отделения мицелия ают смесь токсинов. Осадок разбавляют буферным раствором, При необходимости полученную смесь дополнительно концентрируют. Затем выделяют экзотоксин, обрабатывают его раствором формальдегида и полученный целевой продукт подвергают ультразвуковой обработке. Вакцинацию проводят трижды с интервалом 2-8 недель. Через 12- 18 месяцев после последней инъекции детям вводят еще раз эту вакцину. ния - дукта ления ной ж осажд 15.03.87. Бюл.Такеда Кемикал(1 Р)Юкио Сиукуда, Хидеео Мацуяма ( 1 Р)612.017(088,8) У 10Индаст танабе ТОКС к биотех я биолоГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССС пО ДелАм изоБРеТений и ОткРы(72) и Си (53) 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНБРЕТЕРА РЕНТ 118818 7) Изобретение относит логии и касается получ 61 К 39/1 О, С2 Р 1/02С 12 Р 1/02, С 12 В 1:01Изобретение относится к биотехнологии и касается получения биологическиактивных веществ.Целью изобретения является снижение токсичности целевого продукта 5за счет модификации метода выделенияи детоксикации,Способ иллюстрируется следующимипримерами.П р и м е р ,тамм Тохама фазы1 ВогйеСе 11 а регСлвзз засевают всреду Бурде-Генгу, приготовленную иэкартофеля, пептона, хлорида натрия,агара и бычьей крови, и,инкубируютпри 35 С в течение двух дней. Затемо 5отбирают полупрозрачные круглые колонии, определяют активность к К-агглютинирующей сыворотке и отбираюткультуру в качестве посевной, Производственную среду получают путемавтоклавирования жидкой среды КохеВилера, содержащей: растворимыйкрахмал 225 г, хлористый натрий375 г, двузамещенный Фосфорнокислыйкалий 75 г, гексагидрат хлористогомагния 750 мл (8 весоб,% жидкости),хлористый кальций 75 мл (2 вес,/об,7жидкости), пентагидрат сернокислоймеди 112,5 мл (0,1 вес,/об.% жидкости), глютамат натрия 30 г, нико 30тинамид 4,5 г, казаминовая кислота1800 г, хлоргидрат цистина 4,5 г,трис-буфер 12,5 л, Компоненты средыразбавляют дистиллированной водойдо 150 л, устанавливают рН 7,0-7,2 35и стерилизуют, затем добавляют глутатион (восстановленная Форма) 50 мл( вес,/об.7 жидкости) и ГебО 7 Н О50 мл (1 вес./об,7. жидкости при121 С в течение бО мин с последующим 40обыстрым охлаждением примерно до 40 С.ооСреду хранят при 37 С,Посевную культуру вносят в питательную среду до конечной концентрации 45 200-300 млн, клеток/мл, тщательно перемешивают, высевают по 0,2 л в бутыли Роукса и помещают посевы вотермостат при 37 С, Максимальное количество клеток получают на 5 - й день. 50 Культуральные жидкости из бутылей объединяют, це трифугируют и к надосадочной жидкости добавляют 20,2 вес,/об. сульфата аммония. После тщательного перемешивания смесь выдерживает при 4 С. Через 7 дней надосадочную жидкость сливают и осадок собирают и центрифугируют при 8000 об/мин в течение О мин, Надосадочную жидкость отбрасывают, косацку добавляют 1/10 объема смеси1 М раствора хлористого натрия и0,05 М фосфатного буфера (рН 8,0) исмесь тщательно перемешивают, Смесьовновь выдерживают при 40 С в течение 7 дней, после чего вновь центриФугируют и собирают надосадочнуюжидкость ( экстракт 1) .Экстракт 1 содержит фибрин,лейкоцитозпромотирующий Фактор (ЛПФ),гцстаминиммунизирующий фактор (,ГИФ)и эндотоксин, микробные клетки отсутствуют. Экстракт 1 подвергают повторной концентрации, добавляют кнему равный объем насыщенного раствора сульфата аммония (рН регулируют аммиаком) и выдерживают смесь прио4 С в течение 7 дней. Сульфат- аммониевую Фракцию центрифугируют при0000 об/мин в течение 20 мин, осадок отделяют и добавляют /300 объема жидкой смеси 1 М раствора хлористого натрия и 0,05 М Фосфатного буфера(рН 8,0), После тщательного перемешивания смесь помещают в диализнуютрубку с полупроницаемой мембранойдля удаления сульфата аммония идиализ проводят против 1 М растворахлористого натрия (рН 8,0) . Диализированный концентрат затем центрифугируют при градиенте плотности сахарозы,Предварительно простерилизованныйротор центрифуги емкостью 1700 мли запаянный агрегат вращают с малойскоростью, с помощью градиентногонасоса подают 1300 мл 5-30 вес,/об,7растворов сахарозы, Затем подают100 мл диализованного концентратаи вводят среду покрытия (0,5 М растворхлористого натрия, рН 8,0), Роторвращают при )(ос 89400 в течение18,5 ч. После центрифугирования при малой скорости подают 34 вес,/об,7 раствор тростникового сахара и жидкость из ротора собирают фракциями по 50- 100 мл. Сбор фракций начинают со стороны низкой плотности сахарозы и получают фракции с высокой гемагглютинирующей активностью (не менее 20 ед./мл, предпочтительно не менее 500 ед./мл) и обедненные эндотоксином. Наличие эндотоксина определяют в тесте на кроликах, Каждый образецофракции выдерживают при 100 С в течение 3 мин и разбавляют до содержания20 гемагглютинирующих ед,/мл Физиологического раствора. Разбавленную пробу вводят кроликам внутривенно вдозе 1 мл/кг живого веса. Фракции,не вызывающие жара у кроликов в течение 3 ч, собирают и объединяют вкачестве целевого продукта (экзотоксин 1 .Собранные Фракции, содержащие экзотоксин, разбавляют М/250 фосфатнымбуфером рН 7,0 до содержания белкав пределах 50 мг/мл, Добавляют желатину, Твини тимерозол до конечной концентрации 0,02 вес./об, ,0,05 об./об.7. и 0,01 вес,/об.соответственно. К смеси без добавлениякакой-либо основной аминокислотыдобавляют формалин до концентрации0,2 об./об.в термостате при 39 С и1после тщательного перемешивания 20смесь дополнительно инкубируют в томже термостате. Через 2 дня добавляют Формалин до концентрации0,3 об./об.и после тщательногоперемешивания смесь дополнительно 25инкубируют при той же температуре,Через 2 дня повторяют добавление формалина до концентрации0,4 об./об.и после перемешиванияпродолжают инкубирование в течение 305 дней,Можно обрабатывать смесь0,1 об./об,формалина при инкубировании при 42 С в течение 14 дней, олибо 0,6 об,/об.7 формалина при 35инкубировании при 32 С в течениео14 дней,Полученную суспензию хлопьевидной массы анатоксина диализуют40 0,01 об./об.формалин-физиологическим раствором, идентичным среде покрытия, Диалиэ осуществляют в диализной трубке с мембраной при 12,5- кратном отношении объемов внутренней 45 жидкости и диализирующего раствора при 4 С в течение 2 дней, при этом диализирующий раствор постоянно перемешивают, Через два дня этот раствор заменяют свежим раствором и диализ повторяют. Отдиализированную хлопьевидную суспензию анатоксина подвергают различным испытаниям, применяемым в отношении сырца вакцины коклюша.55Далее суспензию хлопьев анатоксина подвергают ультразвуковой обработке (частота 20-50 кГц, 5 мин) и фильтруют через грубый фильтр -400 меш, в результате чего получаютжидкий анатоксин коклюпа,В качестве контроля ставят опытобработки жидкости, содержащей экзотоксин, Формалином с добавлением0,05 М 1. в лизи и далее обработкупроводят по описанной выше методике,Опытную и контрольную жидкостипорознь обрабатывают по методу Левина. Каждую жидкость разбавляютМ/250 Фосфатным буфером рН 7,0 досодержания белка 20 мкг/мл и меньше,добавляют хлористый алюминий до концентрации 0,18 вес,/об.7 Смесьтщательно перемешивают, регулируютрН до 7,0 соляной кислотой или гидроокисью натрия и отделяют осажденнуювакцину,Проведенные опыты показали следующее: ЛПФ не должен превышать эквивалент 0,5 ЛПГ 1 лейкоцитозпромотирующих ед.)/мл; ГИФ не должен превышать эквивалент 0,8 ГСЕ (гистаминсенсибилизирующих ед.) /м ; эффективность защиты мышей приемлема, когдаона равна ЯМЕ (заражение через тринедели после иммунизации) на 1 мл,Средняя эффективность защиты по14 последовательным партиям составляет,13,5 МЕ/мл, В контроле (с добавлением . -лизина) серия из 23 партийпоказывает полную приемлемость вакцины только в 23 оеП р и м е р 2. Полученный в примере 1 жидкий анатоксин коклюша, жидкий анатоксин дифтерии и анатоксинстолбняка осаждают в соответствии спримером 1 и получают очищеннуюполивакцину против коклюша - дифтерии - столбняка,Состав вакцины: анатоксин коклкгша - содержание белка около 15 мг/мп,анатоксин дифтерии - примерно303/мл; анатоксин столбняка - примерно 5 к 1/мл; алюминия - примерно0,2 мг/мл; тимерозол 0,01 вес,/об.Ж.Поливакцина обладает следующимиосновными свойствами: концентрацияводородных ионов 7,0; пирогенностьдля кроликов (50-кратное разбавление и внутривенное введение из расчета 1 мл/кг живого веса) отрицательная; потеря в весе не превышаетдопустимую норму; активность промоти-.рования лейкоцитоза у мышей не болеечем эквивалент 0,5 ЛПЕ/мл; активностьгистаминсенсибилизации не более чемэквивалент 0,8 ГСЕ/мл; эффективность129771 анатоксина коклюша эквивалентна8 МИ/мп, анатоксина дифтерии -45 МИ/мп, анатоксина столбняка -30 МИ/мл.Вакцинацию проводят по следующейсхеме. Составитель Г.СмирноваРедактор Л.Веселовская Техред М.Ходанкч Корректор Л.Патай Заказ 799/64 Тираж 596 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул,Проектная,4 Детям 3-48-месячного возраста подкожно вводят 0,5 мл каждой вакцины трижды с интервалом 2-8 недель. 10 Через 12-18 мес, после последней инъекции подкожно вводят еще 0,5 мл вакцины. формула изобретения 15 Способ получения анатоксина Вог 1 е 1 е 11 а рег 1 цззз путем культивирования бактерий в первой фазе в пита 2 6тельной среде с последующим отделением биомассы, выделением токсинаиз культуральной жидкости и егодетоксикацией, о т л и ч а ю щ и й -с я тем, что, с целью снижения токсичности целевого продукта, из культуральной жидкости после отделениямицелия осаждают смесь токсинов,осадок разбавляют буферным растворомс добавлением хлористого натрия,полученный концентрат при необходимости дополнительно концентрируютобработкой сульфатом аммония н диализом, выделяют экзотоксин, обрабатывают его раствором формальдегида всоотношении 1".0,1-0,6 об./об.7, иполученный целевой продукт подвергают ультразвуковой обработке при частоте 10-50 кГц