Способ определения сфингомиелина

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 9) 01) 2428 48, 33/50, 33/68,504 С 01 ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМ ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИ ЕТ СССРОТНРЫТИИ(57) Из обопределенретениятитрованимолизинами иооргаого н дуемому мгемолизинь озловская .Б.Еляков т зри квивал за эритро ной массы его конце гемолизин вают содер табл. ш Сш ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕЛК А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Тихоокеанский. институтнической химии Дальневосточучного центра АН СССР) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СфИНГОМИЕЛИетение относится к способу я сфингомиелина. Цель изобупрощение способа за. счет сфингомиелина белками-геморских анемон. К исслетериалу добавляют белкииз морских анемон, Добавоциты. Определяют точку ности по появлению гемолиитов. Исходя из молекуляриспользуемого гемолизина, трации, объема раствора и объема пробы, рассчитыжания сфингомиелина. 31 1242Изобретение относится к биологии,биотехнологии и медицине, в частности к, способам быстрого определениясфингомиелина в органах и тканях, вбиологических продуктах ибиологических жидкостях организма.Цель изобретения - упрощение способа за счет титрования сфингомиелина белками-гемолизинами морских анемон и последующего определения точки эквивалентности по гемолизу эритроцитов.Способ осуществляется следующимобразом,К материалу, содержащему сфингомиелин, добавляют белки-гемолизиныиз морских анемон, затем вносят эритроциты и определяют точку эквивалентности по появлению гемолиза эритроциП р и м е р 1. В серии пробирокделают ряд разведений пробы (сыворотки крови человека), добавляют гемо О лизин РТХ из морской актинииБайьапеЬлз шасгос 1 асу 1 цв (20 мкл, исходная концентрация 100 мкг/мл),смесь инкубируют 30 мин при комнат(ной температуре, затем во все про бирки добавляют по 1 мл 1 У,-ной суспензии эритроцитов. Количественныесоотношения сфингомиелина и гемолизина, а также последовательность операций приведены в табл.1. Таблица 1 Показатели икомпоненты 1Из табл,1 видно, что точка эквивалентности наблюдается в пятой про-. бирке. В предыдущих четырех пробирках концентрация гемолизина избыточна для связывания со сфингомиелином пробы и наблюдается гемолиз тестовых эритроцитов. В пробирках 6-10 количества гемолизина недостаточно для связывания со сфингомиелином, что подтверждается отсутствием гемолиза тестовых эритроцитов. 826 2тов. Исходя из молекулярного весаиспользуемого гемолизина, его концентрации, объема раствора гемолизина и объема пробы, рассчитывают содержание сфингомиелина. Количество сфингомиелина в проберасчитывается исходя из молекулярно 50 го веса гемолизина РТХ (16 000 ед.)и необходимого для взаимодействиясоотношения гемолиаин-сфингомиелин+/- + Сыворотка, разведенная в 100 раз,мкл 5 6 8 10 11 13 15 Гемолизин (50 мкг/мл),мкл 6 8 концентрация раствора гемолизина РТХ, г/л;- объем раствора гемолизина РТХ, л;- молекулярный вес гемолизина РТХ;- объем пробы, л. Поскольку точка эквивалентностинаблюдается в пятой пробирке то С==10г/л; Ч =210 л; Ч=10 л иС ц =О, 0125 ммоль/л,Так. как сыворотка разведена в 100раз, концентрация сфингомиелина вней составляет О, 012510 =1, 25 моль/л.Если молекулярный вес сфингомиелина Из табл.2 видно, что точка экви валентности наблюдается во всех случаях при одном и том же соотношении специфически реагирующих компонен 600, то его концентрация 1,25600:= =, 75 мг/100 мл.П р и м е р 2. В ячейки планшета однократного применения (для про ведения серийного анализа сфингомиелина титрование можно вести в ячейках стандартного планшета для иммунологических реакций) раскапывают се-, рию проб одной.и той же разведенной .в 100 раз сыворотки крови человека, добавляют гемолизин РТХ (исходная, концентрация 50 мкг/мп), инкубируют30 мин при комнатной температуре.Затемво все ячейки добавляют 1 Е-ную 15 суспензию эритроцитов. Соотношениекомпонентов и результаты титрования приведены в табл,2.Таблица 2 10 12 14 16 18 тов. Концентрация сфингомиелина см,определенная по формуле (1), составляет для первой ячейки 4, 1, для второй 3,8, третьей, 4, 1, четвертой1242826 Таблица 3 Пробирка 3 Показатели и компоненты 24 ( 5 Проба сыворотки, разведенная в 100 раз, мкл 6,0 8,0 10,0 12,0 14,070 50 30 10 Физиологический раствор, мкл 9,0 Гемолизин из актинииБ.Ье 11 ап 1 Ьпз, мкл 200 200 200 20 эО 20.,0 Инкубация гемолизина со сфингомелином 30 мин 1 Е-ная суспензия эритроцитов, мл 1,0 1,0 1,0 Инкубация 5 мин+ Гемолиз Сэсавил: И.Гуляева Техред О,Садко Корректор В Бутяга Редактор А,Шишкина Заказ 3697/42 Тираж 778 ПодписноеВНИППИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д.4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г,ужгород, ул.Проектная, 4 4,0, пятой 3,8, шестой 3,9 и седьмой 3,8 мкмоль/л. Средняя концентрация сфингомиелина С =3,92+0,13 мкмоль/лсрП р и м е р 3. В серию пробирок . с разведенной пробой (,проба сыворотки человека та же, что и в примере 1) добавляют гемолизин из актинии Количество сфингомиелина в проберассчитывается исходя. из молекулярной массы гемолизина из актинии8. Ье 11 апсЬпв 16000 и эквимолярноговзаимодействия гемолизина с.о сфингомиелином по формуле 1),Поскольку точка эквивалентности Внаблюдается в третьей пробирке, тоЧг = 2 10 л; Чп = 10 л и С = 10г/ли С = 0 0125 ммоль/л. Так как сысмворотка разведена в 100 раз и концентрация сфингомиелина равна 600, то цС,= 0.,0125 100 "600 = 75 мг/10 млчто соответствует концентрации сфинЬсо 1 сЬас 1 з Ье 11 апгЬпв (20 мкл, исходная концентрация 100 мкг/мл),смесь инкубируют 30 мин при комнатной температуре, а затем во все пробирки добавляют по 1 мл 1/-ной сус-.пензии эритроцитов. Результаты приведены в табл.3. гомиелина, определенной с помощью гемолизина РТХ:Формула изобретенияСпособ определения сфингомиелина путем проведения специфической реакции со сфингомиелином пробы биологического материала, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, сфингомиелин титруют белками-гомолизинами морских анемон, затем дсбавляют эритроциты, определяют точку эквивалентности по появлению гемолиза эритроцитов и рассчитывают содержание сфингомиелина.