Способ определения повреждения мембран эритроцитов

(19) (11) СПУБЛИ 1)4 0 01 1) 33 И Н И И В СНОМУ СВИДЕТ А еди К. Новицкий,рин ици ри 300адосадоч 0 мин Изоббиохи медицине яхФ течение 1 жидкость итроцитов ение относит способам месте астно ценки поврежденицитов.Цель изобретен ембран эритроим слоем эМембраныем гипоосм ляют пуза, при ей срежащуюажден- гично эритроцитов выдтического гемо повышение том в качеы берут 5 мММ ЭДтА и центр ние 2 удаля мамри 10 мМ20 С ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИПРИ ГКНТ СССР(1) Институт биохимии АН БССРи Гродненский государственный мцинский институт(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЕМЕМБРАН ЗРИТРОЦИТОВ(57) Изобретение относ чувствительности способа за счет использования препарата мембран эритроцитов, обработанного эргокаль).+циферолом и РеП р и м е р 1.Берут 5 мл венозной крови и вьщеляют из нее эритроциты, при этом в качестве антикоагулянта используют гепарин (2000 ед./мл), для этого кровь центрифугируют при 300 д в течение 10 мин, плазму и верхний слой эритроцитов, содержащий ,лейкоциты, удаляют, Затем производят трехкратную отмывку, добавляя четырехкратный объем охлажденного Физиологического раствора, каждый раз осаждая клетки центрифугированием 29109 А 1 не и биохимии и может быть использовано для определения повреждения мембран эритроцитов. Цель - повышение чувствительности способа. Мембраны эритроцитов, полученные гипоосмотическим шоком и обработанные ультразвуком, инкубируют с растворомОэргокальцийерола при 37 С 60 мин.и проводят хемилюминесцентный анализ инкубационной смеси. Хемилюминесценцию индуцируют ионами двухвалентного железа. Регистрируют светосумму быстрой вспьпдки хемилюминесценпии. При уровне светосуммы выше 700 имп./мин судят о повреждении мембран эритроцитов. стве гемолизирующМ ИаН РО , содерОдин миллилитр ос эритроцитов быстро и энер емешивают с 20 мл охлажденной 4 С гемолизирующей среды и вьщерают при этой температуре, периоески помешивая, 40 мин. ГемолизатиАугируют при 20000 ц в тече 0 мин. Надосадочную жидкостьют, а осадок мембран эритроцитрехкратно промывают 20 объе итрис-НС 1-бункера (рН 7,4, п ), каждый раз осаждая мембраны триАугированием при 20000 ) в ение 20 мин. Осадок мембран эрит 1529109роцитов переносят в мерные центриЬужные пробирки и доводят 1 О мМ трисНС 1-буЬером (рН 7,4) объем до 1,0 мл, Полученную суспензию мембран эритро-.5 цитов обрабатывают ультразвуком при частоте 44 кгц с выходной электрической мощностью генератора в рабочем диапазоне частоты на активной нагрузке 360 Вт. К 0,2 мл обработанной1 О ультразвуком суспензии мембран эритроцитов добавляют 0,5 мл 0,5 -ного спиртового раствора эргокальциЬерола (конечная концентрация 0,08 .), доводя объем инкубационной смеси до 4 мл 10 мМ трис-НС 1-буЬером (рН 7,4), и инкубируют при 37 С 60 мин, Затем добавляют в инкубационную смесь 1 мл водного раствора сульЬата двухвалентного железа (РеБО )при конечной концентрации его в кювете на 5 мл равной 5 О М, и на хемилюминометре, работающем в режиме счета Ьотонов, регистрируют светосумму инициированной ионами двухвалентного железа 25 быстрой вспышки хемилюминесценции инкубационной смеси при 37 С. Зарегистрированная светосумма отражает интенсивность свободнорадикальных процессов, соответствующую уровню со О держания гидроперекисей липидов, увеличение концентрации которых и указывает на повреждение мембран эритроцитов.Существенно, что мембраны эритроцитов без раствора эргокальциЬерола35 не дают быстрой вспьппки хемилюминесцепции на введение ионов железа.При обследовании мембран эритроцитов практически здоровых людей (50 чедовек) выявлено, что светосумма быстрой вспышки хемилюминесценции составляет 6200+800 имп./мин, При обследовании мембран эритроцитов больных с различной патологией (70 человек) 45 выявлено повышение светосуммы быстрой вспьппки хемилюминесценции инкубационной смеси, содержащей мембраны эритроцитов, до 12000-17500 имп./мин. Следовательно, при уровне светосуммы быстрой вспышки хемилюминесценции инкубационной смеси выше 7000 имп./мин судят о повреждении мембран эритроцитов. П р и м е р 2. Зритроциты получают, как описано в примере 1. Эритроциты смешивают с раствором дигитонина при его конечной концентрации в инкубационной среде 2 мкг/мл;10 мкг/мл и 20 мкг/мл. Инкубационная смесь содержит 1 мл осадка эритроцитов; 8,98 мл Ьизиологического раствора и 20 мкл плазмы крови, содержащей соответствующую концентрацию дигитонина, После 20-минутного выдерживания, смесь центриЬугируют и полученный осадок обработанных дигитонином эритроцитов, как и стандартный образец, используют для гипоосмотического гемолиэа (как описано в примере 1) и последующего определения2+ светосуммы быстрой вспышки Ре -индуцированной хемилюминесценции.Аналогичное исследование было проведено с использованием способа- прототипа.При большем повреждении мембран эритроцитов наблюдается более значительное нарастание светосумми их хемилюминесценции, измеренное по предлагаемому способу 7883 имп./мин, 10982 имп./мин, 15117 имп./мин , что подтверждает адекватность и достаточную чувствительность предлагаемого способа.Формула изобретенияСпособ определения повреждения мембран эритроцитов путем обработки эритроцитов химическими реагентами, индуцирующими хемилюминесценцию, с последующей регистрацией уровня хемилюминесценции, о т л и ч а ю щ и .й - с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, мембраны эритроцитов обрабатывают ультразвуком и инкубируют в спиртовом растворе эргокальбиЬерола при конечной концентрации последнего 0,06 , хемилю-. минесценцию индуцируют ионами двухвалентного железа, затем регистрируют светосумму быстрой вспышки хемилюминесценции, а при этом наличие повреждения мембран определяют при уровне светосуммы вспышки вьппе 7000 имп./мин.