Способ количественного определения, -метил -(3, 4 диоксифенил)-аланина

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСН ИХРЕСПУБЛИН 9) ф(54) (57)ДЕЛЕНИЯ ЬНИЛ) - .алажние аналиствие ее ОГО ОПРЕКСИФЕ- готовлеимодейтом и изПОСОБ о - мет на, в ируем химич КОЛИЧЕСТВЕ Н л-(3,4-ДИ лючающий пр й пробы, вза еским реаген сследуемо ределяют концентра ества ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ЯЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ РСНОМУ СВИДЕТЕЛ(71) Ордена Ленина и ордена Дружбынародов физико-химический институтАН Украинской ССР"Мир", 1965, с. 32-133, 136 в 1.2. Матлина Э,Ш., Киселева З.М.,Софиева И.Э. Методы исследования некоторых гормонов и медиаторов. М.,"Наука", 1965, с. 25 (прототип). мерение спектра, о т л и ч а ю щ и ис я тем, что, с целью упрощения способа определения, повышения экспрессности, воспроизводимос-и и точности результатов, анализируемую пробу подвергают взаимодействию с раствором хлорида тербия в среде вода - изопропанол в соотношении 1:10 .при рН 8,0- 8,5 в присутствии борогидрида натрия с последующим измерением интенсивности полос спектра сенсибилизированной люминесценции тербия, по которой опИзобретение относится к аналитической химии, а именно к способам количественного люминесцентного опре- деления Ьф;метил(3,4-диоксифенил)-аланина (метил-ДОФА). 5В СССР препарат импортируется из Венгрии и Югославии под названием "Допегит" и "Альдомет" соответственно и широко используется как эффективное гипотензивное средство, кото рое вызывает у больных меньше побочных явлений по сравнению с другими .лекарственными веществами.В настоящее время в медицинской практике применяется много способов 15 количественного и качественного определения катехоламинов и родственных им соединений - диоксифенилаланина и дофамина.Известен способ количественного 20 определения диоксифенилаланина, основанный на переведении его во флуоресцирующий триоксииндол. Триоксииндоль- ный метод применяется в различных модификациях, причем всеони включают. 25 стадию отделения с помощью адсорбента, элюацию, обработку окислителем для образования аминохромов, добавление щелочного раствора аскорбиновой кислоты и измерение флуоресценции образовавшегося триоксииндола, Большое число опубликованных модификаций метода говорит о том, что само определение на границах чувствительности метода зависит от многих факторов и от наличия примесей Я . К недостаткам этого способа можно отнести длительность выполнения, возможность наложения спектров люминесценции продуктов окисления адреналина и норад реналина, что делает результаты анализа плохо воспроизводимыми.Наиболее близким к изобретению является способ количественного определения метил-ДОФА в порции мочи. Ме 45 тод предусматривает предварительное выделение метил-ДОФА на окиси алюминия, элюацию его с колонки. В элюате проводят определение метил в ДО.Окисление с образованием флуоресциру ющих продуктов проводится следующимобразом.Уксуснокислый элюат доводят до рН 4,2 1-2 каплями 1 н аммиака, затем отбирают по 1,0 мл в контрольные55 и опытные пробы, в которые предварительно помещают по 1,0 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 4,2. Затем оставшееся количество элюата доводят до рН 6,2, учитывая количество аммиака, пошедшего на титрование, и во две пробы отбирают количество раствора, соответствующее 1,0 мл элюата. В эти пробы предварительно помещают по 1,0 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,2.Солянокислый элюат также доводят 1 н аммиаком до рН 6,2 в мерных пробирках, затем добавляют воды до 7,0 мл. Из этих растворов отбирают в опытную и контрольную пробы по 1,0 мл и предварительно в эти пробир - ки помещают по 1,0 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,2, Три полученные опытные пробы уксуснокислого элюата с рН 6,2 и 4,2 и солянокислого элюата окисляют 0,1 мл 0,25 Е феррицианида калия в течение 4 мин (контрольные пробы не окисляют) и затем добавляют как .в опытную, так и в контрольные пробы 1,0 мл 0,2 раствора аскорбиновой кислоты, свежеприготовленного в 5 н щелочи. Через 3 мин все пробы ,цоводят,водой до 10 мл, а в контрольные пробы добавляют по 0,1,мл 257-ного феррицианида. калия, Для большей стабилизации Флуоресценции опытные и контрольные пробы охлаждают на льду в период измерения флуоресценции. Измерение флуоресценции производят на спектрофлуориметре, используя два набора светофильтров (с диапазоном пропускания от 360 до 600 нм), при двух значениях рН (4,2, 6,2). Путем решения трех уравнений с тремя неизвестными рассчитывают содержание ДОФА и катехоламинов. Путем суммирования со - держания ДОФА в уксусно в кисл и со - ляно-кислом элюатах рассчитывают его общее .содержание 121 .К недостаткам метода можно отнести трудоемкость, наличие множества операций, необходимость работы в широкой области спектра (360-600 нм), отсутствие селективности. Спектральные характеристики продукта окисления ДОФА близки к спектральным свойствам адренолютина и норадренолютина, и, следовательно, возможно наложение спектров люминесценции продуктов их окисления. Это обуславливает, плохую воспроизводимость результатов и недостаточную точность.Цель изобретения - упрощение способа определения метил-ДОФА, повышение экспрессности, воспроизводимости и точности результатов.Поставленная цель достигается тем,что согласно способу количественногоопределения Ж-метил-(3,4-диоксифенил)-аланина включающему приготовление анализируемой пробы, взаимодействие ее с химическим реагентом иизмерение спектра, анализируемую пробу подвергают взаимодействию с раствором хлорида тербия в среде вода -изопропанол в соотношении 1:10 прирН 8,0-8,5 в присутствии борогидриданатрия с последующим измерением интенсивности полос спектра сенсибилизированной люминесценции тербия, покоторой определяют концентрацию исследуемого вещества.Отличиями в предлагаемом способепо сравнению с известным являетсявзаимодействие анализируемой пробысо стандартным раствором хлорида 20тербия в присутствии борогидрида натрия при рН 8,0 - 8,5 и регистрациясенсибилизированной люминесценциитербия в его соединении с метил-ДОФА,обусловленной поглощением света органической частью молекулы и передачей энергии возбужденного состоянияионам тербия, приводит к тому, чтоснижается предел обнаружения по сравнению с известным, значительно упрощается анализ и сокращается время еговыполнения.Поскольку в щелочной среде возможно окисление продуктов реакции кислородом воздуха (аналогично тому,как это наблюдается в реакциях с1,2 - диоксибензол,5 в дисульфокислотой), в предлагаемом способе в реакционную смесь добавляется борогидриднатрия. В известном способе в качест ве растворителя используется вода, впредлагаемом - изопропанол, Интенсивность люминесценции тербия в комплексах с метил-ДОФА в изопропанольныхрастворах на два порядка выше, чем в 45водных.Способ определения осуществляетсяследующим образом,К анализируемому раствору добавляют стандартный раствор хлорида тербия, создают в растворе щелочную среду (рН 8,0-8,5) с помощью борогидриданатрия, регистрируют интенсивностьлюминесценции тербия при Ъ =546 нм.Содержание метил-ДОФА в пробе определяют либо по калибровочному графику,либо по методу добавок. Наименьшееобнаруживаемое количество метил-ДОФА 0,00 1 мкг/мл. При определении метил- ДОФА в биологических жидкостях и тканях, отделение его от катехоламинов осуществляется хроматографическим способом.П р и м е р, Количественное определение метил-ДОФА в лекарственном препарате "Допегит". Одну таблетку препарата "Допегит" тщательно измельчают, растворяют в дистиллированной воде при подкислении соляной кислотой до рН 4,0-5,0, раствор переносят в мерную колбу на 250 мл. Раствор отфильтровывают и в фильграте определяют содержание метил-ДОФЛ.Для получения стандартногораствора хлорида тербия (1 мг/мл) точную навеску оксида тербия растворяют в соляной кислоте, выпаривают до получения влажных солей и разбавляют дистиллированной водой.В пробирку помещают 0,1 мл исследуемого раствора с содержанием метил- ДОФЛ 0,1-0,01 мкг/мл, приливают 0,2 мл стандартного раствора хлорида тербия (содержащего 1 мг/мл ТЬС 1 ), добавляют 0,7 мл дистиллированной воды и 9 мл изопропанола, после этс - го добавляют 1 мг борогидрида натрия для создания необходимого рН раствора и предотвращения окисления растворов комплексов.Спектры люминесценции регистрируют с помощью спектрографа ИСПс ФЗП(либо другого спектрофлуориметра) при Я,с, =546 нм. Пюминесценци 1,1 возбуждают ртутно-кварцевой лампой СВДЛ со сфетофильтром УФС. Растворы комплексов устойчивы во времени и сохраняют люминесцентные свойства в течение получаса. Содержание метил- ДОФА определяют по калибровочному графику, а также по методу добавок, учитывая величину пиков люминесценции пробы и пробы с добавками. При малых содержаниях метил-ДОФА в пробе необходимо регистрировать интенсивность люминесценции холостого опыта и вычитать ее из интенсивности люминесценции пробы. Точность и достоверность способа были проверены в лабораторных условиях путем статической обработки результатов анализа препарата Допегит". Результаты определения метил-ДОФА в препарате "До-. пегит" (п=10, =2,28) представлены в таблице.1168831 Предложенный способ обладает следующими преимуществами по сравнению с прототипом:сокращается время проведения анализа и упрощение его за счет исключения множества операций, необходимых для переведения метил-ДОФА в флуоресцирующие оксииндолы; измерение ийтенсивности люминесценции проводится в видимой области спектра при одной длине волны, повышение точности и воспроизводимости определения за счет исключения наложения спектров люминесценции продуктов окисления других катехоламинов. Введе 0,001,0,005,42 ,26 ,43 Составитель Н,Зоровактор А.Шандор Техред Л.Микеш Корректор А,Обручав 4608/37 Тираж 897 ВНИИПИ Государственного к по делам изобретений и 113035, Москва, Ж, Рауш