Способ получения ни с-меченых 11 -оксистероидов прегненового ряда

ОПИСА Е Б СКОМУ СВ ЕЛЬСТВ К А ии АН Чащин стеро- охонв, ,М 6,МЕ- НЕщий диозом. Заявл ную иммо учение ад около 280 на 1 млупнт- олтьюлка ние ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР(71) Институт биоорганической химБССР(56) Ахрем А.А. и др. Самосборка 11 Видгидроксилирующей системы из мдрий коры надпочечникоБиооргакическая химия, 1979, т.5с,937-939. 54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Н- и Ч Е Н ЫХ 11 Р-ОКСИСТЕ РОИДОВ П НОВОГО РЯДА, включ рансформацию соответствующего Изобретение относится к биохимии, конкретно к усовершенствованному способу получения радиоактивномеченого кортикостерона и кортиэола и может найти применение для синтеза радиоактивномеченых стероидных гормонов глюкокортикоидного и минералокортикоидного ряда, необходимых при создании медицинских радиодиагностических наборов.Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта.Поставленная цель достигается тем, что в способе получения Н- и С-меченых 11 ,В-оксистероидов прегненового ряда, включающем трансформацию соответствующего радиоактивного 11 -дезоксистероида с помощью системы, содержащей иммобилизованные на сефароэе адренодоксин, 11 Р-гидроксилирующий цитохром Р, адре 53)5 С 12 Р 33/00, 33/06, С 07 В 59/00 активного 11 -дезоксистероида с помощью системы, содержащей иммобилизованные на сефарозе адренодоксин, 11 ф-гидроксилирующий цитохром Р, адренодоксинредуктазу и НАДФ-Н - регенерирующую систему. содержащую НАДФ-Н, глюкоза- фосфат и глюкоэо-б-фосфатдегидрогеназу, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта. проводят реконструкцию мультиферментной системы при соотношении белковых компонентов 88 - 118 нмоль адренодоксинредуктазы;220 нмоль адренодоксина;28-35 нмоль цитохрома Р, осуществляемую путем сорбции цитохрома Ри адренодоксинредуктаэы в объеме адренодоксин-сефарозы. нодоксинредуктазу и НАДФ-Н-регенерирующую систему, содержащую НАДФ-Н, глюкозо-фосфат и глюкозо-б-фосфатдегидрогеназу, отличительной особенностью является то, что Ы проводят реконструкцию мультифермент- Я ной системы при соотношении белковых (Я компонентов 88 - 118 нмоль адренодоксин- ф редуктазы:220 нмоль адренодоксина:22 - 35 ф нмоль цитохрома Р, осуществляемую путем сорбции цитохрома Ри адрено- с доксинредуктаэы в объеме адренодоксин- ф сефарозы.Способ осуществляют следующим обраемый способ включает ковал илизацию адренодоксина и енодоксин-сефарозы с емкос нмоль иммобилизованного б отненного сорбента. Насыщесор бента цитохромом Рпроводили с помощью бэтч-варианта сорбции, что включает в себя инкубацию всего объема сорбента с цитохромом Р, Данный способ сорбции белка в отличие от метода фронтальной хроматографии, использованного в прототипе, обеспечивает равномерное распределение молекул во всем объеме аффинного сорбента, Бэтч-адсорбцию цитохрома Рповторяли 4-5 раз, что позволяет сорбировать до 40 нмоль цитохрома Рна 1 мл адренодоксин-сефарозы, Бэтч-адсорбцию адренодоксинредуктазы проводили путем однократной инкубации раствора флавопротеида с адренодоксин-сефарозой, содержащей цитохром Р, что позволяет достигать величин 120-160 нмоль сорбированной адренодоксинредуктазы на 1 мл аффинного сорбента (70 - 80 оот максимальной емкости сорбента в отношение адренодоксинредуктазы.Реконструированную таким образом мультиферментную систему использовали для ферментативной трансформации 11-дезоксистероидов прегненового ряда. Для этого адренодоксин-сефарозу с сорбированными на ней белками набивали в колонку и через полученный колоночный реактор пропускали буферный раствор, содержащий компоненты НАДФ-Н-генерирующей системы (НАДФ-Н, глюкозо-фосфат и глюкозо-б-фосфатдегидрогеназу), а также раствор 1-дезоксистероида с добавкой Н- з либо С-меченого соответствующего стероида,Количественное определение продуктов реакции показало, что использованный в заявляемом способе метод бэтч-адсорбции и измененное количественное соотношение белков позволяет значительно увеличить каталитическую эффективность системы, что выражается в увеличении процента трансформации стероидов, увеличении валового выхода продукта и особенно в увеличении выхода продукта в расчете на 1 нмоль активного компонента мультиферментной системы - цитохрома Р. Данный эффект обусловлен тем, что в заявляемом способе условия реконструкции и количественные соотношения белковых компонентов мультиферментной системы обеспечивают условия для равномерного распределения реакционных центров 11 /3-гидроксилирования во всем объеме сорбента и пространственного сближения центров электронного переноса от адренодоксинредуктазы к адренодоксину и от адренодоксина к цытохрому Р. В отличие от этого в способе реконструкции мультиферментной системы, описанном в прототипе, в результате использования несбалансированных количеств адренодоксинредуктазы и цитохрома Рсоздаются условия для пространственного разделения зон сор бции адренодоксинредуктазы и цитохромаР, что снижает концентрацию активных центров 11 3-гидроксилирования.П р и м е р 1, Для ковалентно-сорбционной реконструкции мультиферментной 11 ф гидроксилазной системы используютгомогенные белковые компоненты этойсистемы - адренодоксинредуктазу, адренодоксин и цитохром Р, выделенные иэ митохондрий надпочечных желез крупного рогатого скота.Ковалентной иммобилизацией адренодоксина на СЙВЧ-активированной сефарозе получают аффинный сорбент адренодоксин-сефароэу, содержащую 220- 330 нмоль иммобилизованного адренодок сина на 1 мл уплотненного геля.Сорбцию цитохрома проводили следующим образом. Раствор с концентрацией цитохрома Р20-30 мкМ в 0,05 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,4), содер жащем 0,3 ф холата натрия, 2 М КС 1, 0,05твина 20 и 20 мкМ 11-дезоксикортикостерона, разводили в 25-30 раз 0,01 М натрийфосфатным буфером, содержащим 10 мкМ 11-дезоксикортикостерона и инкубировали 30 40 мин при ОС адренодоксин-сефарозой израсчета 15 мл раствора цитохрома Р(10-15 нмоль гемопротеида) на 1 мл адренодоксин-сефарозы,Затем сорбент осаждали центрифугированием при 2000 ох 2 мин,су пернатант удаляли и процедурусорбции цитохрома повторяли еще 3-5 раз с новыми порциями раствора белка.Для сорбции адренодоксинредуктазыраствор с концентрацией флавопротеида 3- 40 4 мкМ в 0,01 М натрий-фосфатном буфере(рН 7,4), содержащем 10 мкМ 11-дезоксикортикостерона, инкубировали 20 мин при 0 С с адренодоксин-сефарозой из расчета 10 мл раствора флавопротеида(30 - 40 нмоль 45 белка) на 1 мл адренодоксин-сефарозы. Суспензию сорбента центрифугировали при 2000 ох 2 мин и супернатант с несорбированным белком удаляли.Количества сорбированных белков оп ределяли как по убыли белков в супернатанте, так и после экстракции сорбированных белков с аликвоты адренодоксин-сефарозы.Уплотненную адренодоксин-сефарозу ссорбированными на ней флавопротеидами 55 и цитохромом Рсуспендируют в 0,01 Мнатрий-фосфатном буфере фН 7,4), содержащем 10 мкМ 11 -дезоксикортикостерон и набивают в колонку диаметром 8 мм. Для проведения 11 3-гидроксилазной реакциичерез реконструированную таким образоммультиферментную систему пропускаютфосфатный буфер, содержащий 11-дезоксикортикостерон с добавкой 11-дезокси 1 а,2 а (и)- Н-кортикостерона и компонентызНАДФ-Н-регенерирующей системы:НАДФ-Н, глюкозо-фосфат-дегидрогенаэу. Скорость тока раствора - 1,5 мл/ч, температураС. Элюат собирают порциямипо 0,75 мл с помощью коллектора фракцийи во фракциях количественно определяютсоотношение субстрата и продуктов реакции. Для этого стероиды экстрагируют 6 млэтилацетата, упаривают при температуре невыше 45 С и разделяют с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках с закрепленным слоем силикагеля, используя вкачестве элюента систему бензол:ацетон(13:7). Процент трансформации субстрата определяли по формуле; 100 хВ/(А+8+С), где А -радиоактивность в пятне субстрата реакции,В - радиоактивность в пятне основного продукта реакции, а С - радиоактивность в пятнах побочных продуктов реакции.Колоночный реактор, использованныйдля трансформации Н-меченого 11 -дезокзсикортикостерона, содержал 0,8 мл уплотненной адренодоксин-сефарозы (220 нмольиммобилизованного адренодоксина, 100нмоль адренодоксинредуктазы и 32 нмольцитохрома Р). Элюционный раствор содержал 0,01 М натрий-фосфатный буфер(рН7,4), 100 мкМ 11-дезоксикортикостерона сдобавкой соответствующего Н-меченогозсубстрата в концентрации 1,5 мкКи/мл, 3мМ НАДФ-Н, 5 мМ глюкозо-фосфат и глюкозо-фосфат-дегидрогеназу в количестве2,5 единицы на 1 мл раствора,Образованный продукт ферментативной трансформации 11-дезоксикортикостерона - кортикостерон очищен с помощьютонкослойной хроматографии и идентифицирован на основании сравнения хроматографических подвижностей со стандартомкортикостерона в различных системах растворителей, Радиохимическая чистота пол ученного. кортикостерона составляла 96 Д,П р и м е р 2. Иллюстрирует ферментативную трансформацию С-меченого 11-де 14. зоксикортикостерона в С-кортикостерон,14Реконструкцию мультиферментнои системы и ферментативный цикл проводили, какописано в примере 1, заменяя Н-меченыйз11-дезоксикортикостерон на (4- С-де 14зоксикортикостерон (0,1 мкКи/мл). Колоночный реактор в этом случае содержал 0,8мл уплотненной адренодоксинсефарозы(220 нмоль иммобилизованногоадренодоксина), 88 нмоль адренодоксинредуктазы и 28 нмоль цитохрома Р.Радиохимическая чистота продукта составила в этом случае 95.5 П р и м е р 3. Ферментативная трансформация Н-меченого 11-дезоксикортизозла в Н-меченый кортизол, Приготовление колоночного реактора и цикл ферментативной трансформации проводили согласно 10 примеру 1. В качестве субстрата реакциииспользовали 11-дезоксикортизол с добавкой 11-деэокси,2 . - Н)-кортизола (1,2 мкмКи/мл). Колоночный реактор содержал 0,8 мл адренодоксин-сефарозы (220 нмоль 15 иммобилиэованного адренодоксина), 96нмоль адренодоксинредуктазы и 31 нмоль цитохрома Р.Радиохимическая чистота продукта реакции, идентифицированного на основании 20 сравнения его хроматографических подвижностей с подвижностями кортизола в нескольких системах растворителей, составила 97 ф,.П р и м е р 4. Иллюстрирует ферментативнуютрансформацию С-меченого 11-дезокси 1425 кортикостерона в С-меченый кортизол.14Реконструкцию мультиферментной системы и ферментативный цикл проводили согласно примеру 1, используя в качестве субстрата 11-дезоксикортикол с добавкой 30 (4- С)-11-дезоксикортизола (0,1 мкКи/мл).Колоночный реактор содержал 0,8 мл адренодоксинсефароэы (220 нмоль иммобилизованного адренодоксина), 118 нмоль адренодоксинредуктазы и 35 нмоль цитох рома Р.Радиохимическая чистота полученногоС-кортизола составляла 96.В таблице приведено сравнение каталитических эффективностей реконструиро ванных мультиферментных систем взаявляемом способе ферментативной трансформации и в прототипе. Поскольку основным компонентом мультиферментной системы, содержащим каталитический 45 центр 11 р-гидроксилирования, является цитохром Р, параметры каталитической эффективности системы нормированы к 1 нмолю цитохрома. Из данных таблицы следует, что заявляемый способ ферментатив ной трансформации в 2,8 - 3,1 раза болееэффективен для 11 Р-гидроксилирования 11- дезоксикортикостерона и в 2,3-2,5 раза - для трансформации 11-дезоксикортизола.При этом увеличивается процент трансфор маций субстрата - до 753 для 11-дезоксикортиэола и до 62- для 11-дезоксикортизола по сравнению с прототипом (40-50 в обоих случаях). Общее количество 11 Р-оксистероидов. полученное за1132544 с прототипом в 5,7-6,3 раза для кортикостерона и в 3,1-3,5 раза для кортизола,1 цикл трансформации в расчете на 1 нмоль цитохрома Р, возрастает по сравнению Параметр Гидроксилирование 11-дезоксикортикостерона(3,6:6,7;1) 677 639 360-450 540 616 22,8 21,2 6,8-7,5 17,4 17,6 750 360-4501356 1290 42,4 6,8-7,5 46,1 71 60- Расчет произведен на одно и то же количество субстрата, поданного в колоночный реактор (900 нмоль,Редактор Л,Письман Заказ 571 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина. 101 Количество белковых компонентов в реконструированной системе -адренодоксинредуктаза: адренодоксин: цитохром РВыход 11 ф-оксисте- роида: суммарный,нмоль в расчете на 1 нмоль цитохрома Р, нмоль нмоль В ыход 11 В-оксистероида эа полный реакционный цикл:общее количество продуктаэ,нмоль количество в расчете на 1 нмоль цитохрома Р, нмоль/нмольТрансформация субСоставитель А.ПавловаТехред М,Моргентал Корректор Э.Лончакова