Способ получения ни с-меченых 11 -оксистероидов андростенового ряда

(51 ЕНТНОЕ ГОСУДАРСТВЕННО ВЕДОМСТВО ССС (ГОСПАТЕНТ ССС ОБРЕТ ОПИСАН К АВТОРСКОМ ЛЬСТВ, С,П. Марц оспев. апб07 - 314,. "Агс 90. й. 1 3Н и .СМЕДОВ АНДРОключающий ющего радиоазы, адлярных чаемую адреной сорбох рома состоящую ренодоксин соотношени путем ковал доксина на цией на адр Ри адр Способм обра(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕНЫХ 11 Р - ОКСИСТЕРОИ СТЕНОВОГО РЯДА, трансформацию соответству Изобретение относится к области биохимии, конкретно к усовершенствованному способу получения радиоактивно меченых стероидов андростенового рязда и может найти применение для синтеза Н- и С-ме 14 ченых 11 Р -оксиандростенов, необходимых для создания медицинских радиодиагностических наборов,Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта.Поставленная цель достигается тем, что в способе получения Н- и С-меченых 11З 14Р -оксистероидов андростенового ряда, включающем трансформацию соответствующего радиоактивного 11 Р -дезоксистероида с помощью системы, содержащей адренодоксинредуктазу. адренодоксин, цитохром Ри систему регенерации НАДФ-Н, отличительной особенностью является то, что используют иммобилизованную мультиферментную систему,активного 11 Д-дезоксистероида с помощью системы, содержащей адренодоксинредуктазу, адренодоксин, цитохром Ри систему регенерации НАДФ-Н. о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, используют иммобилизованную мультиферментную систему, состоящую из адренодоксинредуктазы, адренодоксина и цитохрома Рв молярных соотношениях 2,7-3,2:6,3 - 7,9:1 и получаемую путем ковалентной иммобилизации адренодоксина на сефарозе с последующей сорбцией на адренодоксин-сефарозе цитохрома Ри адренодоксинредуктазы,из адренодоксинредукт а и цитохрома Рв мо ях 2,7-3,2:6 - 7,9:1 и полу ентной иммобилизации сефарозе с последующе енодоксин-сефарозе цит енодоксинредуктазы. осуществля ют следующи зом.Заявляеную иммобучение адресорбента цимощью бэтвключает всорбента сет равномемолекул вота. Бэтч-адзы проводифлавоп роте мыи способ включает ковалентилизацию адренодоксина и полнодоксин-сефарозы. Насыщение тохромом Рпроводили с поч-варианта сорбции, который себя инкубацию всего объема цитохромом Ри обеспечиварное распределение белковых всем объеме аффинного сорбенсорбцию адренодоксинредуктали путем инкубации раствора ида с адренодоксинсефарозой, 1135191содержащей цитохром Р. Сорбционный способ иммобилизации адренодоксинредуктазы и цитохрома Рпутем взаимодействия с ковалентно иммобилизованным адренодоксином дает возможность образования биоспецифических белок;белковых комплексов, являющихся каталитически компонентными, Таким образом, ковалентно-сорбционный способ реконструкции 11 ф-гидроксилаэной системы соединяет в себя преимущества ковалентной иммобилизации, такие как стабильность иммобилизованного фермента. с возможностью биоспецифического пространственного контакта белковых компонентов, обеспечивающего, функционирование мультиферментной системы,При реконструкции мультиферментной системы использовано молярное соотношение адренодоксина, цитохрома Ри адренодоксинредуктазы, варьирующее в пределах (6,3-7,9):1:(2,7-3.2). Данное соотношение компонентов позволяет избежать чрезвычайно высоких (150-кратных) молярных избытков адренодоксина, использованных в прототипе и обеспечивает более эффективное по сравнению с прототипом. использование белка,Реконструированную таким образом мультиферментную систему использовали для ферментативной трансформации тестостероина и андростендиона, Для этого адренодоксин-сефарозу с сорбированными на ней белками набивали в колонку и через полученный колоночный реактор пропускали буферный раствор. содержащий компоненты НАДФ-Н-регенерирующей системы (НАДФ-Н, глюкозо-фосфат и глюкозо- фосфат-дегидрогеназу), а также раствор Н- - либо 4 С-меченого тестостерона или андростендиона.Количественное определение продуктов реакции показало, что заявляемый способ получения 11 Р -оксиандростенов позволяет значительно увеличить временную стабильность мультиферментной системы и пролонгировать работу ферментативного реактора до временных интервалов в 10-20 ч и более вместо нескольких минут согласно условиям, описанным в прототипе. Это позволяет повысить процент трансформации субстрата до 65. Кроме того, применение иммобилизованной ковалентно-сорбционным способом 11 3.гидроксилазной системы делает возможным многократное использование белковых компонентов ферментативной системы, поскольку гидроксилированный продукт покидает зону реакции, и экстракция элюата, 50 55 Для сорбции адренодоксинредуктазы раствор с концентрацией флавопротеида 3- 4 мкМ в 0,01 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 10 мкМ тестостерона, инкубировали 20 мин при 0 С с адренодоксин-сефарозой из расчета 10 мл раствора флавопротеида на 1 мл сорбента. Суспензию центрифугировали при 20009 х 2 мин и супернатант с несорбированным белком удаляли,вытекающего из колончатого реактора, органическим растворителем не приводит кденатурации белковых компонентов.Способ отличается от прототипа тем,5 что в заявляемом способе вместо растворимой 11/3-гидроксилазной системы использована. иммобилизованнаяковалентно-сорбционным способом ферментативная система 11 /3-гидроксилирования, что обеспечивает высокуювременную стабильность системы и получение Н- и С-меченых стероидов в количе 3 14ствах, во много раз превышающихвозможность способа, описанного в прото"5 типе (таблица), а также дает возможностьмногократного использования иммобилизованной ферментативной системы.П р и м е р 1, Для ковалентно-сорбционной реконструкции мультиферментной 1120 /3-гидроксилазной системы используют гомогенные белковые компоненты этой системы -адренодоксинредуктазу, адренодоксин и цитохром Р, выделенные из митохондрийнадпочечных желез крупного рогатого скота.Ковалентной иммобилизацией адренодоксина на СИВЧ-активированной сефарозе 4 Вполучают аффинный сорбент -адренодоксин-сефарозу, содержащую 220-330 нмольиммобилизованного адренодоксина на 1 мл30 уплотненного геля,Сорбцию цитохрома Рпроводилиследующим образом. Раствор с концентрацией цитохрома Р20-30 мкМ в 0,05 натрийфосфатном буфере (рН 7,4),35 содержащем 0,3 холата натрия, 2 М КО,0,05;ь твина 20 и 20 мкМ тестостерона, разводили в 25-30 раз 0,01 М натрий-фосфатным буфером, содержащим 10 мкМтестостерона и инкубировали 40 мин при40 0 С с адренодоксин-сефарозой из расчета15 мл раствора цитохрома Р(10 - 15нмоль гемопротеида) на 1 мл адренодоксинсефарозы.Затем сорбент осаждали центрифугиро 45 ванием при 20009 х 2 мин, супернатант удаляли и процедуру сорбции цитохромаповторяли еще 3-5 раз с новыми порциямираствора белка.Количественную оценку сорбированных белков проводили как по убыли белков из супернэтанта инкубационной суспенэии, так и после зкстракции сорбированных белков с эликвоты адренодоксин-сефарозы,Уплотненную эдренодоксин-сефарозу с сорбированными на ней флавопротеидом и цитохромом Рсуспендируют в 0,01 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,4). содержащем 10 мкМ тестостерона и набивают в колонку диаметром 8 мм. Для проведения 1 1 Р-гидроксилазной реакции через полученный таким образом колоночный реактор пропускают фосфатный буфер, содержащий 1,2,6,7- Н)-тестостерон и комзпоненты НАДФ-Н-регенерирующей системы; НАДФ-Н, глюкозо-б-фосфат и глюкоза-б-фосфатдегидрогеназу. Скорость тока раствора 1,5 мл/ч, температура - 20 С. Элеат собирают порциями по 0,75 мл с помощью коплектора фракций и во фракциях количественно определяют соотношение субстрата и продукта реакции, Для этого стероиды экстрагируют б мл зтилэцетэта, упаривают при температуре не выше 45 С и разделяют с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках с закрепленным слоем силикагеля, используя в качестве элюента систему бенэол:ацетон 13:7, Процент трансформации субстрата определяли по формуле: 100-.В/(А+ В + С), где А - радиоактивность в пятне субстрата реакции, В - радиоактивность в пятне основного продукта реакции, С - радиоактивность в пятнах побочных продуктов реакции.Колоночный реактор, использованный для трансформации зН-меченого тестостерона, содержал; 0,8 мл уплотненной адренодоквинсефароэы (220 нмоль иммобипизованного эдренодоксина), 90 нмоль адренодоксин-редуктазы и 28 нмоль цитохрома Р. Элюционный раствор содержал: 0,01 М натрий-фосфатный буфер,(рН 7,4), 100 мкМ тестостерон с добавкой зН-тестостерона в концентрации 1,8 мкКи/мл, 3 мМ НАДФ-Н, 5 мМ глюкозо-б-фосфэт и глюкоэо-б-фосфатдегидрогеназу в количестве 2,5 единицы на 1 мл раствора.Полученный целевой продукт - Н-мечез ный 11 Р-окситестостерон очищен с помощью тонкослойной хроматографии и идентифицирован на основании сравнения хроматографических подвижностей со стандартом 11 Р-окситестостерона в различных системах растворителей, Радиохимическая чистота полученного продукта была не ниже 940 П р и м е р 2. Пример иллюстрирует ферментативную трансформацию Н-мече- з5 10152025 3035 40 представленных в таблице, демонстрирует преимущества заявляемого способа получения 118-оксиандростенов по сравнению с прототипом. Реакция 11 Р -гидроксилирования в способе. описанном в прототипе,45 50 55 длится несколько минут. Авторы работы, взятой за прототип, не приводят параметров временной стабильности ферментативной системы, однако известно. что ферментативная реакция, проводимая при 37 С, прекращается в течение нескольких минут из-эа быстрой инактивэции фермента. Так, растворимая мультиферментная система 11/3-гидроксилирования теряет около 300 активности эа 8 мин функционирования при 37 С.Активность 11/3-гидроксилирования андростендиона иммобилизованной системой остается практически неизменной в течение 20 ч. Стабильность иммобилиэованной ферного андростендиона, Реконструкцию мультиферментной системы и ферментатив 1 ый цикл проводили, как описано в примера 1, используя в качестве субстрата реакции андростендион с добавкой Н-меченого аидростендиона в концентрации 1,7 мкКи/мл, Колоночный реактор в этом случае содержал 0,8 мл уплотненной адренодоксинсефарозы (220 нмоль иммобилизованного адренодоксина), 94 нмоль адренодоксинредуктазы, 28 нмоль цитохрома Р, радзиохимическая чистота продукта реакции - Н-меченого 11 Р- оксиандростендиона, идентифицированного на основании сравнения хроматографических подвижностей со стандартом 11 3-оксиандростендиона в различных системах растворителей, составляла 95 ои более.П р и м е р 3. Ферментативная трансформация 1 С-меченого андростендиона.Приготовление колоночного раствора ицикл ферментативной трансформации проводили согласно примеру 1. В качестве субстрата реакции использован андростендион с добавкой (4- С-андрост 144-ен,17-диона в концентрации 0,1 мкКи/мл. Колоночный реактор содержал 0,8 мл адренодоксин-.сефарозы (220 нмоль иммобилизованного адренодоксина, 88 нмопь адренодоксинредуктазы и 31 нмоль цитохрома Р. Радиохимическая чистота продукта реакции, идентифицированного на основании сравнения его хроматографических подвижностей с подвижностями стандарта 1 1/3 -оксиандростендиона внескольких системах растворителей. была не менее 95%.Анализ интегральных параметров каталитической эффективности иммобилизованной 11 ф -гидроксилазной системы,1135191 1- за 20 ч потеря ферментативной активности составила 15 2 - за 20 ч потеря ферментативной активности составила 1843 - в расчете на 2 мин проведения ферментативной реакции,ментативной системы, охарактеризованная по времени потери системой 30 активности, в 80 и более раз выше, чем стабильность растворимой системы.Благодаря высокой стабильности иммобилизованной 11,8-гидроксилазной системы возможно проведение длительных циклов трансформации и получение миллиграмовых количеств стероидных продуктов. Несмотря на то, что активность растворимой системы, рассчитанная на единицу содержания цитохрома Р, выше чем иммобилизованной, применение ее для получения 11/3 -оксиандростенов ограничено из-за большого расхода белковых компонентов и невозможности их повторного использования. Так, для получения 2 мкмоль 11/3 -окситестостерона при использовании растворимой ферментативной системы и работе в кинетическом концентрационном и временном диапазо нах параметров реакции, потребовалось бы 33 нмоль цитохрома Р, т.е. примерно столько же, сколько взято для ферментативной трансформации андростенов иммоби"1(оличество белковыхнентов в реконструир(нмоль)Время потери ферменой системой 30 "актВыход 11/3-оксистерполный цикл трансфообщее количестпродуктаколичество прорасчете на 1 нмцитохрома Р(н моль/н моль)Суммарный процент тма ии с бст ата лизованной системой. Однако необходимое количество адренодоксина должно было бы составить 4,5 мкмоль, т,е. в 20 раз больше, чем при использовании иммобилизованной 5 системы, При этом расход адренодоксинабыл бы выше, чем выход целевого продукта.а повторное использование белковых компонентов невозможно, В то же время использование ковалентно-иммобилизованного 10 андренодоксина открывает возможность ренатурации этого белка, инактивированного в ходе стероидгидроксилазной реакции. Высокие молярные избытки адренодок сина над цитохромом Р(150-кратные)использованы в прототипе для достижения максимальной каталитической активности в течение очень короткого промежутка времени.Использование 11 ф-гидроксилазной системы, 20 реконструированной ковалентно-сорбционным способом, кроме указанных выше преимуществ в стабильности дает возможность резки снизить избытки адренодоксина над цитохромом до б - 8-кратных при сохране- М 25 нии каталитической активности системы.