Штамм -1, используемый для внутривидовой дифференциации иерсиний чумы

(54)ЗУЕМЬ 1, 101. о иаучно- умного ции иер ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ(71) Всесоюзный ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"(56) Ларина В.С., Мельников Н.Ф., .Тимофеева Л.А. и др. Сравнительная характеристика активных фаговых корпускул чумных и псевдотуберкулезногофагов. Сб"Проблемы ООИ", Саратов, У 4, 1977, с,13. ШТАММ РНАСОМ РКБТ 8 М1 Й ДЛЯ ВНУТРИВИДОВОЙ ДИФФЦИАЦИИ ИЕРСИНИЙ ЧУМЫ(коллекция фагов Всесоюзноисследовательского противоинститута "Микроб" ),.исполдля внутривидовой дифференцисиний чумы.Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использованопри бактериологическойдиагностике чумы для целей внутривидовой дифференциации иерсиний чумы,а также в генетических и микробиологических экспериментахИзвестны псевдотуберкулезный ичумный диагностические бактериофагидля дифференциации подвидов чумногомикроба.Однако известные бактериофаги. лизируют 98-99% штаммов псевдотуберкулеэного микроба и 57% музейный культур воэбудйтеля чумы, что приводит кдиагностическим ошибкам.Целью изобретения является получение бактериофага с узким спектромлитической активности в отношении отдельных групп штаммов возбудителя чумы и повьппение качества дифференциации бактерий иэ различных природныхочагов чумыПоставленная цель достигается использованием штамма РЬадиш реяСяМ.Для получения фага были изученына наличие фагов, активных в отношении бактерий чумы, 150 свежевыделенных и музейных штаммов Е.со 1,Один из изученных фильтратов (К-.235) образовывал на штамме 1.реяйдя400(290) (Закавказское высокогорье)единичные мелкие неправильной формыотносительно прозрачные негативныеколонии.С целью выделения однородной популяции фага проведена селекция негативных колоний. Чистая линия фагаМ.-1 была получена путем 10-кратногопассирования отдельных негативных колоний на штамм,1.Рея 1 дя 400(290).Бактериофаг Мдепонирован в лаборатории,холерных фагов с музеем института "Микроб" за У 101.Штамм Мчумного умеренного фага имеет следующие морфологические и физиологические характеристики.Частица фага Мимеет головку гексагональной формы размером 51,4+ +2,3 нм, отросток длиною 14,4+1,6 нм, шириной 14,2+0,4 нм и сокращающийся чехол (длина в состоянии сокращения 50+1,8 и ширина 201,7 нм, что дает основание отнести этот фаг к 1 морфологической группе).Бактериофаг Мобразует относительно прозрачные колонии диаметром30 Для получения препарата фага М фо 18-часовую бульонную культуру штамма 1.РеяСя 400(290) вносят в свежий бульон Хоттингера из расчета конечной концентрации 510 клеток нао1 мл; после 6 ч подращивания при 28 С 45с постоянным шюттелированием и достижением культурой плотности 2-310 клеток на 1 мл добавляют фаг М иэ расчета множественности инфекции 0,1- 0,4. Через 16-18 ч шюттелирования 50 55 5 О 5 20 25 0,5-1 мм, отличающиеся от. крупных(4-8 мм) негативных колоний извест. ного псевдотуберкулезного фага.Одиночный цикл развития на штамме 1.Резня 400(290) характеризуется следующими показателями: константа скорости адсорбции 2,4 ф 10 мл/мин,9латентный период 90-100 мин, средний урожай 8,4 фаговых частиц на 1бактериальную клетку.В табл,1 приведена серологическая характеристика фага М.По серологическим свойствам бактериофаг Мотносится к 11 серотипучумных фагов (табл.1).Диапазон и специфичность действияфага Мизучены на 985 штаммах возбудителя чумы, 184 культурах псевдотуберкулезного микроба и 57 штаммахвозбудителя кишечного иерсиниоза.Испытания проведены в сравнении спсевдотуберкулеэным диагностическимфагом (табл.2).В табл.2 приведена литическая активность чумных бактериофагов М,Л"С" и псевдотуберкулезного диагностического в отношении штаммовбактерий рода 1 егяпа,П р и м е р. Фаг Мрепродуцируется на клетках штамма Т.Рея 1 Ы 400(290) в бульоне Хоттингера, рН 7,2При посевной дозе 2-3108 клеток1на 1 мл среды и множественности инфекции 0,1-0,4 при инкубации с постоянным шюттелированием в течениео16-18 ч при 28 С накапливается до и 10 фаговых частиц на 1 мл.8 опри 28 С к фаголизату добавляют хлороформ до 2% по объему. Фаголиэат с добавленным хлороформом выдерживают 1,5-2 ч при комнатной температуре (20-24. С) и 10-12 ч в холодильникео(4-6 С).Затем фаголиэат фильтруют через бактериальные фильтры марки Ф-З, Ф. Полученный фильтрат разливают по ампулам и контролируют на специТ аблица Фаг Сыворотка ЛффС Псевдоту- беркулезный диаг- ностичес- кий МАнтифаговаяЕ серотипа О/О/О/Антифаговая 11 серотипа 98/83,72 98/300 О/АнтифаговаяМ99,6/441,6 97,2/283,4 О/П р и м е ч а н и е. Числитель - % нейтрализованных фаговых корпускул;знаменатель - константа нейтрализации. Таблица 2е еьтура Оча Количество исслеКоличество штаммов лизирующихся фагами, Х дуемых культу-413 Псевдотуберкулезный диагностичес- кий- Закавказскиравнинно- предгорный озбуель 0 98 акавказск ысокогорный 4 99,5 242 фическую и общую стерильность и активность.Фаг М, подобно типовым фагам других видов, используют для фаготипирования штаммов возбудителя чумы в дифференцирующем рабочем титре (ДРТ). ДРТ фага определяется следующим образом: 18-часовую бульонную индикаторную культуру 1.Рея 1 я 400(290) в объеме 0,3 мл .вносят в пробирку с 4,5 мл расплавленного и остуженного до 47 С 0,7 Х-ного агара Хоттингерао(рН=7,2), перемешивают и содержимое пробирки выпивают на поверхность агаровой пластинки (1,27-ный агар Хоттингера, рН 7,2),После застывания . второго слоя на его поверхность петлей или штампом наносят десятикратные 06834 4разведения фага М. После подсыхавния капель посевы инкубируют при 28 С в течение 18-20 ч; За дифференцирующий рабочий титр принимают то разведение, в котором фаг Мобразует на месте нанесения не менее 1 О негативных колоний. Изучение чувствительности иссле- О дуемых культур к фагу Мпроводит.ся так же, как и определение дифференцирующего рабочего титра.Использование фага М- в практикелабораторного исследования позволит 5 повысить эффективность зпизоотологических, микробиологических, генетических исследований, направленных наборьбу с возбудителями чумы;1106834 Продолжение табл. 2 Количество исслеКультура Очаг дуемыхкультур МПриараксинский 100 100 27 0 Дагестанский горный 00 46 100 0 ЦентральноКавказский 100 97,2 0 36 Горно-Алтайский 100 216 98,1 100 100 100 Тувинский 97 0 Забайкальский 100 100 62 0 Гиссарский 1.00 100 90 10 Прикаспийскийстепной 100 100 101 0 Африка,Ю.Америка 00 100 0 Возбудитель 3,2 98,1 184 0 Возбудитель ки-. шечного иерсиниоза 0 0,6 57 0 Редактор Е.Месропова Техред Л.Олейник Корректор Л 1 Патай Заказ 1339/3 Тираж 490 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5псевдотуберкулеза Количество штаммов лизирующихся фагами, 7. ДПсевдотуберкулез"С" ный диагностичес- кий Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул.Проектная, 4