Способ определения негемадсорбирующих вирусов

ОЮЗ СОВЕТСКИХОЦИАЛИСТИЧЕСНИХСПУБЛИН 1 060 Я 19 2 н 7 ГОСУД АРСПО ДЕЛ ЕННЫЙ КОМИТЕ ЗОБРЕТЕНИЙ И О П И Т го " -, г,ДЩф"файс:-"к:;, р ВУ К РСКОМУ СВИДЕТЕЛ"ЭеСесС 1 опСре 1 - ьпГеацпегепсеАВовСоп, Маве.Соп, Р.С. 198 Бюл, Р 46ов н И.Л.Коганский ордена "Знак Босследовательский ининфекций88,8)Х БЬе 1 оаоч А,а 881 цСпаС 1 оп СевС чгцв п шопКеу сц 1 Сцге.-еБсепсе 358-359.Л,У, Нцапа Ае 8Ьегрев .в 1 шр 1 ех ч 1 гце сСец Се 11 в Ьу ЬасСег 1 а 1 епСв апц СЬешоСЬег 1979, чо 1 1, чавЬ 1 щр. 536 (прототип).(54),57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕГЕМАДСОРБИРУОЯИХ ВИРУСОВ путем их выращивания в культуре ткани с последующим наслоением суспензии стафилококков Сочап 1, сенсибилизированных противовирусной сывороткой, инкубированием реакционной системы и учетом полученных результатов, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, стафилококки дополнительно сенсибилизируют антиэритроцитарной сывороткой, при этом противовирусную и антиэритроцитарИую сыворотки берут в количестве 100 вируснейтрализующих и 100 гемолитических доз соответственно, пос.ле инкубнрования добавляют взвесь Ф эритроцитов и определяют вирус по наличию гемадсорбции.Изобретение относится к вирусологии и касается способа определения негемадсорбирующих вирусов.Известен способ определения вирусов в реакции гемадсорбции на поверхности зараженных клеток 17.5Однако известный способ не позволяет определить генемадсорбирующие вирусы.Известен способ определения негемадсорбирующих вирусов, напримервируса герпеса, путем их выращиванияв культуре. ткани с последующим наслаиванием суспензии стафилококковСоап 1, сенсибилизированных противовирусной сывороткой, инкубированием реакционной системы и учета полученных результатов Г 2 3.Однако известный способ трудоем=кий, так как предусматривает сложную методику подготовки вирусов для 2 пучета результатов,Цель изобретения - упрощение способа.Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу определе 25ния негемадсорбирующих вирусов путем их выращивания в культуре ткани с последующим наслоением суспенэии стафилококков Сочап 1, сенсибилизированных противовирусной сывороткой, инкубированием реакционнойсистемы и учетом полученных результатов, стафилококки дополнительносенсибилизируют антиэритроцитарнойсывороткой, при этом противовирусную и антиэритроцитарную сывороткиберут в количестве 100 вируснейтрализующих и 100 гемолитических дозсоответственно; после инкубированиядобавляют взвесь эритроцитов и определяют вирус по наличию Гемадсорб-.40и,ии.Способ осуществляется следующим образом.10-ную взвесь золотистого стафилококка штамм Кован 1, инактивиро ванную формальдегидом, соединяют с гипериммунными сыворотками двух видов - против искомого вируса и гемолитической в соотношении 1:1:1 по объему, Активность используемых50 сывороток должна быть не менее 100 вируснейтрализующих доз для противо- вирусной сыворотки и не менее 100 гемолитических доз для противоэритроцитарной сыворотки. Время контак- у та сывороток со стафилококком - 40 мин при комнатной температуре. Полученную взвесь стафилококков отмывают дважды в трехкратном объеме ФБР рН,2 - 7,4, Для постановки способа используют 1-ную взвесь стафилококков в ФБР. В каждую пробирку с зараженной культурой клеток и в контрольные пробирки вносят по 1 мл 1-ной,.взвеси стафилококков и после 15-минутного контакта прикомнатной температуре производяттрехкратную отмывку клеточного пласта ФБР от неадсорбированных стафилококков. Далее в пробирки вносят по1 мл 0,4-ной взвеси эритроцитов,смесь инкубируют 10 мин и производят аналогичную отмывку ФБР. Наличие адсорбции эритроцитов на зараженные клетки определяют тремя способами: визуально по окрашиваниюклеточного пласта в рыжий цвет; полмалым увеличением микроскопа (100раз ) непосредственно в пробиркахили матрицах; для количественногоучета дозы вируса адсорбированныеэритроциты:лизируют дистиллированной водой, внося ее по 1,5 мл в каждую пробирку и измеряют количествовируса по количеству гемоглобина,вышедшего из адсорбированных эритроцитов, на спектрофотометре придлине волны 410 нм по сравнению сконтролями - незараженная культураклеток и дистиллированная вода.Время постановки способа составляет 1,0 - 1,5 ч.П р и м е р 1. Для определенияприсутствия вируса герпеса простого готовят стафилококковый диагностикум путем соединения 2 мл 10-нойвзвеси стафилококков с 1 мл иммунной кроличьей противогерпетическойсыворотки в разведении 1:3 (титрсыворотки 1:320 ) и 1 мл гемолитической кроличьей сыворотки противэритроцитов барана в разведении1:10 (титр сыворотки 1:1200). Послеконтакта в течение 40 мин при 20 Сополученный диагностикум 2 раза отмывают в ФБР с центрифугированиемпри 3000 об/мин в течение 15 мин.Готовый препарат ресуспендируют до10-ной концентрации,Культуру клеток Нер 2 заражаютвирусом герпеса простого штамм Толстой в разведении 10 титр вируса101 и респираторно-синцитиальнымРСвирусом в разведении. 10 " (титрвируса 10 4). Через 1 и 2 сут послезаражения в пробирки с зараженнойкультурой клеток и в контрольныепробирки вносят по 1 мл 1-ногостафилококкового диагностикума.После 15-минутного контакта при комнатной температуре диагностикумсливают и трижды отмывают клеточный пласт ФБР от неадсорбированныхстафилококков. Затем в пробирки вносят по 1 мл 0,4 эритроцитов баранана 10 мин, после чего пласт сноваотмывают ФБР и производят трехэтапный учет результатов: визуальныйучет по окрашиванию пласта; полуколичественный учет под микроскопом1 подсчет бляшек адсорбции ); коли"чественный учет по количеству гемоЦитопатогенный эффект Количество днейпослезаражения Культура клетокВизуальный По количествугемоглобина по срав.нению сН 20 в оптическихед ОЕ) Под микроскопомНезараженная Отрицатель-,.ный Отрица- тельный Отрицательный 0,020 0,015 0,085 Около40 бляшек Слабое рыжеватоеокрашиваниепласта Зараженнаявирусомгерпеса 0,400 Сплошная гемадсорбция Рыжее окрашиваниепласта глобина в адсорбированных зритроцитах, для чего в каждую пробиркувносят по 1,5 мл дистиллированнойводы. Количество гемоглобина опре"деляют на спектрофотометре при .цлине волны 410 нм.Полученные результаты представлены в табл. 1.Из табл. 1. видно, что адсорбциякомплекса стафилококк-эритроцит нанезараженную культуру клеток и назараженную не соответствующим иммунной сыворотке вирусом клеточнуюкультуру крайне незначительна (0,0100,020 ОЕ ), а на зараженные вирусомгерпеса клетки уже в первые суткиадсорбция эритроцитов превышаетконтрольный уровень в 4 раза10,085 ОЕ ), на вторые сутки - более,чем в 20. раэ (0,400). Цитопатоген-.ный эффект в зараженной вирусом герпеса простого клеточной культурепоявился лишь на 7 сут и только понему без постановки реакции нейтрализации идентифицировать вирус практически невозможно,П р и м е р 2. Осуществляют способ аналогично примеру 1, но определяют присутствие РС-вируса илиаденовируса.Результаты определения приведе-ны в табл. 2.Иэ результатов опыта видно, чтоначиная,с первых суток после заражения культуры ткани возможно подучение гемадсорбции, превышающейконтрольный уровень в 4 - 7 раэ.При этом одновременно с получе- .10 нием гемадсорбции, учитывая применение специфических антивирусныхсывороток, происходит и идентификация вируса. По сравнению с использованием реакции нейтрализации в куль 15 туре ткани, применяемой обычно,ответ может быть получен на 1-2 сутки после заражения культуры ткани. исследуемым материалом, т.е. на 510 дней раньше, чем в реакции нейтрализации.Использование изобретения позволяет быстро выделить и идентифициро.вать этиологический агент, что значительно облегчает и сокращает вре мя работы по диагностике, что особенно важно при диагностике острыхвирусных инфекций центральной нервной системы у детей. Учет адсорбции эритроцитов10 б 0674 ЮТаблица 2 Культураткани Диагностикумиз стафилококка + антиэритроцитарная сыворотка + НаличиеЦ П Э 0,070 Заражена РС +вирусом Отрицательный 0,295 0,420 0,450 Отрицательный 0,010- -0,025 ЗараженаЬдено вирусом 1 Отрицательный 0,015-0,035 Отрицательный Незараженная1-7 Отрицательный 0,010-0,030 1-7 0,010-0,035 г Составитель А,МаныкинРедактор Н.Киштулинец Техред О,Неце Корректор О. Билак Заказ 9971/28 Тираж 523 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5+ анти Ад сыворот- ка Количестводней после заражения культуры ткани Учет гемадсорбции в оптических единицах 0,060 0,310 0,400 0,530