Способ определения объема эритроцитов в биологической ткани

СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 727067 А 1 01 й 33 ГОСУДАРСТВЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР МИТЕТТКРЫТИЯМ 3 р (,САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ВТОРСКОМУ. СВИД ЛЬСТ институт И,Ленина, Смирном крови в ормативы ов. В кн.: состояния ск, 1983,ЪЕМА КАНИ что итмобр 1(71) Казанский государственныйусовершенствования врачей им, В(56) Поспелов В,СЛеонтьев В.Ква В.Б Поспелова В. И. Объемиокарде. Метод определения; нвлияния экстремальных факторЭкстремальные и терминальныев клинике и эксперименте, Омс. 63-65.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯЭ РИТРОЦИТОВ В БИОЛОГИЧ ЕСК Изобретение относится к медицине, а. именно к нормальной и патологической физиологии сердечно-сосудистой системы, и предназначено для характеристики внутриорганноо кровенапслнения при воздействии различных возмущающ х факторов.Известен способ оценки объема эритроцитов в навеске биологической ткани, основанный на способности гемоглобина гемолизата с помощью метгемоглобинобразователя (феррицианида) и цианистой сали образовывать цианметгемоглобин, концентрацию которого измеряют фотометрически. После определения количества гемоглобина в заданном объеме эритроцитов крови вычисляют объем эритроцитов в исследуемой ткани.Однако, при использовании известного способа из-за мутности фотометрируемого раствора (наличие белка в пробе) величина(57) Использование: для определения объема эритроцитов и исследования функции внутриорганных сосудов при действии различных экстремальных факторов. Сущнвсть изобретения: после окрашивания гемолизата производят повторное центрифугирование, в качестве красителя используют смесь, состоящую из амидопирина, анилина сернокислого и этилового спирта, объем эритроцитов в.тканях определяют по формуле Ч=К(Етк Ек)l(Еэр Ек), где Ч - объем эритроцитов в ткани, мкл/г, Етк - экстинкция пробы ткани; ЕЭР - экстинкция пробы эритроцитов крови; Е- экстинкция пробы контроля на реактивы; К - постоянный коэффициент,экстинкции существенно., завышается, ведет к снижению показателя объема эр роцитов в ткани.Цель изобретения - повышение точности способа.Способ осуществляют следующи азом.После забоя животного тушку промораживают при -15 ОС в течение 3-х ч. Выделенный кусочек органа взвешивают и .гомогенизируют в дистиллированной воде в соотношении 1:10. Гемолизат ткани центрифугируют при 6000 об/мин в течение 15 мин.Параллельно извлекают кровь, которую стабилизируют 5-ным раствором цитрата натрия и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 15 мин. К 0,1 мл эритроцитарной массы добавляют 4,0 мл дистиллированной воды. Гемолизат эритроцитов центрифугируют при 6000 об/мин в течение 15 мин.В три пробирки вносят но 1,0 мл дистиллированной воды, 1,0 мл красителя (70,0- 80,0 мл 20-ного водного раствора амидопирина, 70,0-80,0 мл 50 -ного водного раствора анилина сернокислого и 96- ного этилового спирта до 500,0 мл) и 0,8 мл 3-ной перекиси водорода. В первую пробирку добавляют 0,2 мл супернатанта ткани, во вторую - 0,2 мл супернатанта эритроцитов крови, а в третью - 0,2 мл дистиллированной воды (контроль на реактивы). Содержимое первых 2-х пробирок перемешивают и центрифугируют при 6000 об/мин в течение 5 мин.Через 15 мин после прибавления красителя пробы спектрофотометрируют при дли, не волны 540 нм, Длина оптического пути кювет 10 мм;Объем эритроцитов в биологической ткани рассчитывают по формуле(Еэр - Ек) х 2 где Ч - объем эритроцитов в ткани, мкл/г; Етк - экстинкция пробы ткани; Еэр - экстинкция пробы эритроцитов крови;Е - экстинкция пробы контроля на реактивы;5 - объем эритроцитов крови в пробе, мкл; 2 - масса ткани в пробе, мг; 1000 - коэффициент пересчета из мг в г, П р и м е р 1, У белой беспородной крысы - самца массой 130 г после забоя передозировкой эфирного наркоза и промораживания тушки в морозильной камере холодильника при -15 С в течение 3-х ч взяты для анализа навески следующих органов: печени (массой 95 мг), почки (массой 60 мг), селезенки (массой 65 мг) больших полушарий мозга (массой.70 мг).Обработка биогогической ткани и крови проведена по предлагаемому способу. Состав красителя, мл: 20%-ный водный раствор амидопирина 70,0; 5%-ный водный раствор анилина сернокислого 70,0; 96%- ный этиловый спирт да 500,0. Результаты измерения экстинкции проб; Печень 0,452; Ет - Ек=0,422; Почка 0,207; Ет-Е=0,177; Селезенка 0,219: Етк-Ек=0,189; Большие полушария мозга 0,073; Етк-Е=0,043; Эритроциты крови 2,480; Еэр - Ек=2,450; Контроль 0,030,Исходя из формулы Ч= Етк - Е Х 5 Х 1000, объем эритроцитовЕэр - Ек) х 2 составляет, мкл/г: в печени 430,6; в почке 180,6; в селезенке 192,9, в больших полушариях мозга 43,9.П р и м е р 2, У белой беспородной крысы - самца массой 200 г после забоя передозировкой эфирного наркоза и проморажива ния тушки в морозильной камере холодильника при -15 С в течение 3-х ч взяты для анализа навески следующих органов: печени (массой 80 мг), почки (массой 65 мг), селезенки (массой 90 мг), больших полушарий мозга (массой 60 мг).Обработка биологической ткани и крови проводилась по предлагаемому способу. Состав красителя, мл; 20%-ный водный раствор амидопирина 75,0; 5%-ный водный раствор анилина сернокислого 75,0; 96- ный этиловый спирт до 500,0 мл. Результаты измерения экстинкции проб: Печень 0,426; Ет - Ек=0,402: Почка 0,213: Етк-Е=0,189; 25 Селезенка 0,207: Етк - Е=0,183;Большие полушария мозга 0,064; Етк - Е к=0,040; Эритроциты крови 2,252; Еэр Ек=2,228; Контроль 0,024, 30 Исходя из формулы Ч=, объем эритроцитовЬр - Ек) х 2 составляет, мкл/г: в печени 451,1, в почке 212,1, в селезенке 205,3; в больших полушариях мозга 44,9,П р и м е р 3. У белой беспороднойкрысы-самца массой 150 г после забоя передозировкой эфирного наркоза и промораживания тушки в морозильной камерехолодильника при -15 С в течение 3-х ч взяты для анализа навески следующих органов:печени (массой 60 мг), почки (массой 60 мг),селезенки (массой 85 мг), больших полушарий мозга (массой 70 мг).Обработка биологической ткани и кровипроводилась по предлагаемому способу.Состав красителя, мл: 20%-ный водный раствор амидопирина 80,0; 5%-ный водный50 раствор анилина сернокислого 80,0; 96%ный этиловый спирт до 500,0 мл,Результаты измерения экстинкции проб:Печень 0,439; Етк-Ек=0,412;Почка 0,227: Етк-Ек=0,200:Селезенка 0,216, Етк Ек=0,189;Большие полушария мозга 0,078; Етк-Е к=0,051;Эритроциты крови 2,520; Етк Ек 2 493;Контроль 0,027.(Е - Е ) где Ч - объем эритроцитов в ткани, мкл/г;Етк - экстинкция проб ткани;Еэр - экстинкция пробы эритроцитов крови;Е - экстинкция пробы контроля на реактивы,К - постоянный коэффициент. 30 Составитель В. МалышевТехред М.Моргентал Корректор Э. Лончакова Редактор Н, Шитев Заказ 1276 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент"г. Ужгород, ул;Гагарина, 101 Исходя из формулы ЧЕтк - Ек х 5 х 1000, объем эритроцитовЕэр - Ек) х 2составляет, мкл/г: в печени 413,2; в почке 200,6; в селезенке 189,5; в больших полуша риях мозга 51,1.. При использовании предлагаемого красителя в предлагаемом способе после повторного центрифугирования проб и удаления осадка фотометрируемый раствор 10 оказывается прозрачным. В результате становится возможным точное измерение концентрации гемоглобина в пробе, что делает более объективным и информативным способ определения объема эритроцитов в на веске биологической ткани. Способ прост в исполнении, не требует высокотоксичных и дефицитных реактивов, а также дорогостоящего оборудования. Он может с успехом использоваться при изучении состояния ре гионарного кровенаполнения сосудов в условиях нормы и патологии, при действии различныхвазоактивных препаратов. Формула изобретения25 Способ определения объема эритроцитов в биологической ткани путем гемолиза эритроцитов, центрифугирования, окрашивания гемолизата с последующим измерением экстинкции пробы ткани против контроля, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, производят повторное центрифугирование после окрашивания гемолизата, в качестве красителя используют смесь, состоящую из 20-ного амидопирина, 5-ного анилина сернокислого, 96-ного этилового спирта, при следующих соотношениях компонентов, мас,;Раствор амидопирина 14-16 Раствор анилинасернокислого 14 - 16 Этиловый спирт Остальное, а объем эритроцитов определяют по формуле