Способ получения диагностикума

А СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК А 61 К 3 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКР ОПИСАНИЕ ИЭ АВТОРСНОМУСВИДЕ(21) 3354898/28-13 (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИ- (22) 31.07.81 КУЙА для серологической идентификации (46) 15,09.84. Бюл. Мф 29 коклюшных бактерий путем связывания (72) С,Ф.Алимова, В.Н,Милютин, иммуноглобулинового сенситина с мат- Е.П.Москаленко и Т.А.Славянскаярицей на основе полистирола в буфер- (71), Ростовский-на-Дону государст- ном растворе при рН 7,5-7,7, о т л и. венный научно-исследовательский , ч а ю щ и й с я тем, что, с целью противочумный институт и Ростовский : повышения серологической активности -на-Дону ордена Дружбы народов госу- диагностикума, в качестве матрицы дарственный медицинский институт . используют смесь полистиролсульфохло. (53) 615.373,34(088.8) рида и полистирола, обработанного (56) 1. Кирицева А.Д. Реакция пассив диазометаном, взятых в весовом соотной гемагглютинации при коклюше, " ношении 3:1, а в качестве сенситинаЖурнал микробиологии, эпидемиологии смесь равных количеств иммуноглобули. и иммунобиологии, 1966, У 2, 127. нов М и 9 из коклюшной агглютинирую 2. Авторское свидетельство СССРщей сыворотки и процесс ведут в при- Р 544431, кл. А 61 К 39/44, 1975. , сутствии 1-27-ного бычьего альбумина3. ЭпЬег Б.М., Бекешей Р., Апп. в течение 13,5-14 ч при повышении 1 пзТ. Разеепт, 1953, 84, 2, 370, . температуры от 20 до 34 С.Изобретение относится к области медицины, в частности к серологическим методам экспресс-диагностики кок люша.До сих пор единственным методом ранней диагностики коклюша является бактериологическое исследование. Это объясняется тем, что в катаральный период болезни, который длится 2 недели, отмечается наиболее высокая 1 О высеваемость коклюшных бактерий, и больной в значительной мере опасен из-за отсутствия характерных клинических симптомов. Однако даже при проведении многократннх бактериоло гических исследований купировать распространившуюся вспышку весьма затруднительно. Последнее определяется тем, что коклюшная палочка относится к медленно растущим микроорганизмам, 20 ,поэтому резульаты посевов становятся известными не ранее чем через 48- 72 ч после взятия материала. За это время инфицированные дети с еще не- развившимися клиническими симптомами 25 или болеющие легкими и атипичными формами являются источниками распространения инфекции.Все вышеизложенное свидетельствует о необходимости качественно нового ЗО подхода к решению вопроса ранней лабораторной диагностики коклюша и об актуальности проведенных исследований. Время ответа о наличии возбудителя в материале от больного можно З 5 сократить при использовании серологического метбда, позволяющего идентиФицировать его в короткий срок. Для этой цели могут быть применены эритроцитарные антительные диагностикумы 40 способ получения которых состоит в связывании сенситина - коклюшного гамма-глобулина с эритроцитами "11, 1Выявляемая концентрация коклюшных бактерий в 1,0 мл составляет 8 10- 45 1,6 О микробных клеток. ОднакоЬдаже при условииподбора оптимальньж, режимов сенсибилизации эритроцитов гамма-глобулином или другим сенситином, разрушающая способность эритро О цитарных препаратов ограничена прежде всего особенностями самого биологического носителя и характером взаимодействия (Физико-химическим) между сенситином и матрицей, Кроме того, 55 большое значение имеет качество самих эритроцитов, зависящее от многих условий, таких, как пол, возраст,гормональный статус животного-продуцента, время взятия крови.В связи с этим воспроизводийость результатов может варьироваться,Таким образом, причинами, затрудняющими использование эритроцитарных диагностикумов, являются недостаточная их активность в серологических реакциях, лабильность эритроцитов к воздействию экстремальных факторов, затруднения при стабилизации и стандартизации эритроцитарных препаратов и т,п, Перспективным направлением является создание иммуноглобулинового диагностикума на синтетической основе. Такой подход позволяет повысить активность и специфичность препарата за счет стереокомплементарности гомологических структур - активных центров антител и антигенных детерминантИзвестен способ получения пиагностикумов для серологических реакций на основе синтетических частиц, который заключается в связывании иммуноглобулина против грамотрицательных бактерий с матрицей - полистиролсульфохлоридом в буферном растворе при рН 7,2-8,5 в течение 3 ч при 20 С и 12 ч при 4 С 2.Диагностикумы используют для серологической идентификации возбудителей особо бпасных инфекций, в том числе и коклюша. Однако получение препаратов по этому способу не обеспечивает достаточной серологической активности при удовлетворительной специфичности препаратов, что снижает чувствительность и усложняет учет реакций. Активность диагностикумов в реакции агломерации изменяется от 10 до 10 -10 ч.микробных клеток в 1,0 мл. При создании коклюшного иммуноглобулинового диагностикума по указанному способу выявилась еще одна особенность - препараты приобретают свойство спонтанно склеиваться.Целью изобретения является получение диагностикума для серологической идентификации коклюшных бактерий с повышенной серологической активностью,Поставленная цель достигается способом получения дианостикума для серологической идентвикации коклюшных бактерий путем свяявания иммуноглобулинового сенсити.а с матрицей на основе полистирол в буферном растворе при рН 7,5-7,7 в котором в качестве матрицы предлагается испольэовать смесь полистиролсульфохлорида, и полистирола, обработанного диазометаном, взятых в весовом соотношении 3:1, а в качестве сенситина - смесь равных количеств иммуноглобулинов й и 2 иэ коклюшной агглютинирующей сыворотки и процесс вести в присутствии1-2 -ного бычьего альбумина в течение 13,5-14 ч при повышении температуры 10 от 20 до 34 С.Введение в матрицу полистирола, обработанного диазометаном, обусловливает цветовой эффект, в результате чего повышается наглядность серологического теста.Выбранное соотношение между компонентами позволяет более рационально расходовать исходное сырье и обеспечивает эффективность выявления кок люшных бактерий.При увеличении кислотности буферного раствора наблюдается хлопковавие антител, а в резко щелочной среде снижается процент связывания сенсити нов с синтетическим носителем.В течение 13,5-14 ч происходит мак. симальное связывание искусственно скомпонованных растворов коклюшных иммуноглобулинов (на 97-987). УвеличеЗ 0 ние времени иммобилизации поэтому нерационально. В течение меньшего времени иммобилизации не удается полу. чить высокоактивный диагностический препарат. 35Температурный режим выбран с учетом особенностей используемых сенситинов, При более высокой температуре происходит самоагрегация иммуноглобчлинов.40Постепенное увеличение температуры при иммобилизации необходимо для наиболее полного связывания иммуноглобулинов М и В. Частицы матрицы в присутствии большого количества бел ков приобретают способность к самоагрегации, в связи с чем возникает необходимость введения стабилизаторов.Полученный продукт обладает высо кой сорбционной емкостью. Выявляемая концентрация коклюшных бактерий в исследуемом материале до 1 10" микробных клеток в 1,0 мп.П р и м е р. 30 мг порошка, 55 состоящего иэ смеси (31.1 по несу сухого компонента) сульфохлоридполистирола и полистирола, обработайного диаэометаном и измельченного до размера частиц 1-8 мкм, смешивают в 10 мл 0,15 М фосфатного буфера с 10 мг иммуноглобулинов М и ф в присутствии 0,1 г альбумина и 0,02 Х- ного раствора пиридина, Выделение гамма-глобулинов иэ коклюшной агглютинирующей сыворотки проводят с помощью метанола 31, разделение имму- . ноглобулинов - на колонке с сефадексом 6-200, Иммуноглобулины М искусственно выделяют из больших количеств агглютинирующей сыворотки иФ концентрируют в меньшем объеме, после чего антитела классов М и "Усоединяют в равных пропорциях. рН среды строго выдерживают равным 7,6, экспонируют 14 ч, постепенно повышая температуру от 20 до 34 С. Затем трижды по 10 мин отмывают центрифугированием при 3000 об/мин 1,5 Е-ным раствором аминокислотного экстракта углеводородных дрожжей БВК. Осадок взвешивают в 1,57-ном растворе того же экстракта и лиофилиэируют.Методика постановки реакции.На обезжиренное стекло наносят О, 1 мл исследуемого материала, добав ляют 1 каплю диагностикума. Стекло покачивают в течение 1 мин, оставляют на горизонтальной поверхности и через 2-5 мин проводят учет. При положительном результате появляется агломерация частиц диагностикума. В отрицательном случае суспензия остается гомогенной.Испытывают 3 серии диагностикума в 5 повторностях. Диагностикум проверяют в реакции агломерации с гомо-, гетерологичными вэвесями чистых и смешанных культур (соотношение бактерий с гетерокультурой 1;1, 1:19 1:100). Для сравнения используют эритроцитарные диагностикумы, приготовленные иэ тех же серий сывороток, в РНГА. Специфичность реакций подтвержрают торможением.В результате испытаний препараты зарекомендовали себя как высокоактивные, специфичные, сохраняющие свою первоначальную активность в течение 3 лет. Предлагаемый способ обеспечивает выявление минимальных количеств коклюшных бактерий как в чистых, так и в смешанных культурах, что особенно важно при исследовании материала от.Заказ 7494/1 Тираж 687 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва Ж, Раушская наб д. 4/5 МФилиал ППП "Патент", г. Ужгород. ул. Проектная. 4 больных. Новый способ экономическивыгоден, поскольку значительно сокраЩает время исследования. Кроме того,быстрое выявление боЛьных обеспечивает своевременную .изоляцию их и прерывает дальнейпее распространениеинфекционного начала среди детскогоконтингента,