Способ получения маннана

(9) (И) 3(511 С 12 Р 19/04 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКОМУ ТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Научно-исследовательский институт физико химических проблем Белгородского университетаим.В.И. Ленина(56) .1. Сапас 1 ап Зоцгпа 1 СЬеайвйгу, 1965, 43. 950-954.2. Авторское свидетельство СССР Р 580214, кл, С 12 Р 19/04, 1976. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАННАНА путем культивирования дрожжей рода РЬрдосогц 1 а на питетельной среде, содержащей глюкозу в качестве источника углерода, минеральные соли и витамины, отделения культуральной жидкости от биомассы, подщелачивания нативного раствора до рН 6,5-7,0, концентрирования с последую. щим выделением и очисткой целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюувеличения выхода манйана, упрощения процесса и умень щения расхода используемых реагентов, после отделения культуральиой жидкости от биомассы нативный раствор нагревают до 40-70 С, а концентрирование осуществляют путем ультрафильтрации на гидратцеллюлозных мембранах, имеющих производи-тельность по воде при давленииЪ0,1 МПа 25-62 л/м ч, предварительно обработанных водой при 90-120 С и давлении 0,1-0,2 МПа.Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к синтезу биополимеров, в частности маннанов, используемых в медицинской промышленности.Известен способ получения манна-на, заключающий в ферментации на питательной среде дрожжей рода ВЪодоогц 1 а отделением культуральнойжидкости суперцентрифугированием,осаждении масс -сырца.иэ нативногораствора этанолом, очистки реактивом Фелинга, разрушении медно-маннанового комплекса 1 н НС 1 и осаждениичетырьмя объемами метанола 1.1.Активность получаемого по иэвестному способу маннана невысока, чтои является недостатком данной технологии,Наиболее близким к изобретениюпо технической сущности и достигаемОму эффекту является способ получения маннана, согласно которомудрожжи рода ВЬодо 1 огц 1 а выращиваютна питательной среде, содержащейглюкозу в качестве источника угле- р 5рода, минеральные соли, витамины,отделяют затем культуральную жидкость суперцентрифугированием и полученный натйвный раствор доводят дорН 6,57,0, после чего упаривают ввакууме в 8-10 раэ, осаждаютманнан-сырец равным объемом этанола при рН 4,8-5,0, осадок деониэируют катионитом и осаждают этанолом.Известный способ позволяет получатьбольшие количества маннана со стабильными параметрами, пригодного дляиспользования в качестве биологически-активного соединения, Выход очищенного маннана составляет около 55по отношению к маннану-сырцу С 23. 40Однако известный спбсоб являетсямногостадийным, требует значительного расхода. химический реагентов, априменение в процессе выделения маннана стадии вакуум-выпаривания приводит к уменьшению биологической активности препарата и большим энергозатрат ам,Цель изобретения - повышение выхода маннана, упрощение процесса иуменьшения расхода используемыхреагентов,Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу получениямаинана, предусматривающему культивирование дрожжей рода 11 Ьодоогц 1 ана питательной среде, содержащейглюкозу в качестве источника углерода, минеральные соли и витамины,отделение культуральной жидкости отбиомассы, подщелачивание нативного 60раствора до рН 6,5-7,0,онцентрирование с последующим выделением иочисткой целевого продукта предусмотрено после отделения культуральной жидкости от биомассы, нативный 65/ЧН 4/ 50,К 112 Р 04М 950+. 7 Н О14 аС 1 2,5 г 1,0 г 0,5 г 0,1 г 0,1 г СаС 1 28 0 Витамины; В 0,4 мг; В 0,2 мг;В 0,4 мгГлюкоза 50 гна 1 л водопроводной воды с рН 5,35,4. Среду разливают в колбы Эрленмей.ера емкостью 750 мл по 300 мл истерилиэуют в автоклаве при 0,5 атив течение 30 мин. Раствор витаминов,стерилизованный ультрафиолетовымилучами, вносят непосредственно передзавесом культуры,раствор нагревать до 40-70 С, а кон центрирование осуществлять путем ультрафильтрации на гидратцеллюлоэных мембранах, имеющих производительность по воде при давлении 0,1 МПа 25-62 л/м ч, предваритель 2но обработанных водой при 90-120 С и давлении 0,1-0,.2 Мпа.Предварительный нагрев нативного раствора до 40-70 С позволяет провести его концентрирование и частичную очистку методом ультрафильтрации, Использование же ультрафильтрации при температурах меньше 40 С нецелесообразно ввиду низкой производительности процесса и потерь целевого продукта. Повышение температуры нативнбго раствора выше 70 С также нежелательно иэ-за возможного протекания деструкции полисахарида и снижения его биологической активности.Использование полимерных мембран с указанными характеристиками обусловлено следующими причинами. При значениях производительности мембран выше 62 л/м ч не достигается2необходимая степень задерживания целевого продукта, а применение мембран с водопроницаемостью ниже 25 л/м ч нецелесообразно ввиду их недостаточной производительности.Ультрафильтрацию необходимо прородить на гидратцеллюлозных мембранах ввиду того, что ультрафильтраты иэ других полимерных материалов не обладают достаточной устойчивостью в среде культуральной жидкости при повышенных температурах и не могут быть использованы для концентрирования маннан-содержащих растворов,П р и м е р 1, В качестве продуцента полисахарида используют дрожжи КЬодосогц 1 а гцЪга штамм ВКМ У.В качестве посевной и ферментационной сред используют среду следующего состава:1011685 Для выращивания посевного материа- ла производят засев среды двух-трех- суточной культурой дрожжей, выращенной на сусло-агаре при 250 С, в виде 2 млрд, взвеси по бактериальному стандарту по 7,5 мл в колбу. Подращивание ведут в течение 48 ч при :24-25 С и перемешивании 220 об./мин. Полученный инокулум вносят в Ферментационные колбы в количестве 10 мл ,и выращивают при тех же .температурах 10 и режиме перемешивания. 15 В таблице представлены данные по концентрированию. Мембрана Производитель ность по воде,л/м.чТемператураобработкимембраны,горячейводой,С Средняя производительность по нативному раствору,л/м ч Температура нативного раствора,фС%2,46 44 100 Холостой опытъ% Мембрана разрушилась после трех циклов концентрирования. раствор маннана отфильтровывают от катионита ЕУ-8 /Сц/ на ворон ке Бюхнера. Последний промывают80 мл дистиллированной воды,.промывные воды присоединяют к основному раствору, производят корректировку рН, доводя его значение до 60 4,8-5,0 раствором йаОН, и осаждаютдвумя объемами этилового спирта.Осадок чистого маннана промывают этиловым спиртом и сушат в вакууме.Выход очищенного маннана составляет око ло 65 по отношению к маннану-сырцу. Полученную в результате Ферментации культуральную жидкость отделяют от Клеток суперцентрифугированием. при 28-29 тыс.об./мин.Полученный нативный раствор, содержащий 2,0-2,2 г/л маннана подщеКонцентрат, полученный в результате ультрафильтрациИ, центрифугируют при 6000-7000 об./мин. К центри Фугату добавляют 12,5 мл реактива Фелинга. Выпавший осадок медноманнанозого комплекса отделяют от маточника на воронке Бюхнера, промывают 2-ным водным раствором КОН,затем этанолом. Промытый осадок переносят в стакан, добавляют 80 мл дистиллИрованной воды, 6,25 г катионита КУ-8/Н+/ и перемешивают в течение 30 мин. Деиониэированный лачивают 0,1 н раствором НаОН до рН 6,5, нагревают до 60 С и концент рируют ультрафильтрацией на гидратцеллюлоэных мембранах с производительностью по воде 25-62 л/м ч.4 Ультрафильтрацию проводят на фильтре мембранном ФМ 02-1000 при давлении 0,3 МПа. Перед ультрафильтрацией в ячейку заливают воду с температурой 110 С и под давлением 0,1 - .0,2 МПа проводят обработку мембран в течение 0,5-1 ч. Ультрафильтрацию проводят до тех пор, пока объем исходного раствора не уменьшится в 10-12 раз1011 б 85 Составитель И, ЛаринаРедактор Т. Парфенова Техред М, Гергель Корректор В, Бутяга ееИ ае юе Щ Заказ 2888/32 Тираж 521 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП "Патентф, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Использование предлагаемого способа получения маннана позволяет полностью исключить из технологического процесса стадии вакуум-упаривания, корректировки рН, осаждения спиртом и др., т.е. избежать промежуточного выделения маннана-сырца и, соответственно, потерь целевого продукта. Предлагаемый способ позволяет существенно снизить расход химических реагентов, упростить оборудование и увеличить. выход очищенного маннана на 10 ( б 5 против 55)по отношению к маннану-сырцу, полученному по известному способу(