Способ получения диагностикума для проведения реакции бентонитовой флокуляции

(51) М. Кл. з А 61 К 39/00 Гасударственный квмитет Опубликовано 23.08.82. Бюллетень 3Дата опубликования описания 28.08.82(53) УДКЬ 616-07 (088.8) вф делам изобретений и еткрмтий(72) Авторы изобретения Владивостокский научно-исследовательскийинститутэпидемиологии и микробиологии и Дальневосточныйгосударственный университет(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИИ БЕНТОНИТОВОИ ФЛОКУЛЯЦИИ 1Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выявления антигенов и антител.Известен способ получения диагностикума для проведения реакции бетонитовой флокуляции путем адсорбции антигена или антител на частицах бетонита при инкубировании смеси с последующей отмывкой целевого продукта 1.Однако известный способ не позволяет получить диагностикум, обладающий высокой чувствительностью реакции. Целью изобретения является повышение чувствительности реакции.Поставленная цель достигается тем, чтосогласно способу получения диагностикума 15 для проведения реакции бентонитовой флокуляции путем адсорбции антигена или антител на частицах бентонита при инкубировании смеси с последующей отмывкой целевого продукта, для адсорбции используют частицы бентонита размером 0,0006 - 0,0009 мм в концентрации 1,7 - 1,9 мг/мл воды.Способ осуществляют следующим образом. 2В качестве сырья для получения бентонитового диагностикума используют бентонитовые глины различных месторождений СССР, а именно Устиновского (РСФСР), Огланлы (Таджикская ССР), Аскания (Грузинская ССР). Бентонит подвергают специальной обработке. Для разрушения карбонатов глину обрабатывают 1 н. соляной кислотой, а затем 0,1 н. Образовавшиеся растворимые соли и кварц удаляют путем отмывания дистиллированной водой. Для этого глину с помощью воды переносят в вегетационные стаканы (20 х 12 см). На каждый стакан наносят метки: первая на высоте 3 см от дна, вторая на 7 см выше, третья на 7 см выше второй. Дистиллированную воду доливают до третьей метки, взмучивают в ней бентонит и оставляют на 12 ч для отстаивания. Когда твердая часть глины оседает, а над ней остается прозрачная жидкость, то последнюю удаляют сифоном и вновь наливают дистиллированной воды до верхней метки. Когда суспензия остается во взвешенном состоянии, приступают к отмучиванию частиц величиной 0,0006 0,0009 мм. Для этого в стаканы наливают дистиллированную воду до верхней метки, 9522603содержимое перемешивают, через 24 ч погружают сифон на глубину 7 см и с его помощью суспензию переливают в стакан-приемник. Отмучивание продолжают до просветления суспензии. В стаканы-приемники ккаждой новой порции суспензии добавляют 53 - 4 капли концентрированной соляной кислоты для коогуляции и осаждения суспензии, Фракцию отмывают дистиллированнойводой, а затем высушивают в водяной бане.190 мг этого бентонита суспендируют в100 мл дисталлированной воды, в результате, чего получают высокоактивную суспензию иммунноадсорбента.За счет удаления при отмывании из бентонита кварца и растворимых солей происходит увеличение процентного содержащия 1 ьглинистой составляющей (монтмориноллитовой фракции) до 80 - 90%, что обеспечивает повышение адсорбционных свойств глины.Приготавливаю антигенный бентонитовый диагностикум на основе полученного иммунноадсорбента, В качестве антигена используют 10 млрд. взвесь суточной агаровой культуры шигеллы Флекснера и шигеллы Зонне, которую прогревают в водянойбане в течение 2 - 4 ч при 100 С с последующим центрифугированием при 4000 об/минв течение 1,5 ч. Бентонитовую суспензиюсмешивают с антигеном в соотноешнии 1:2(5 мл суспензии и 10 мл антигена). Сенсибилизацию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин, затем смесь центрифугируют при 2200 об/мин в течение 7 мин.Осадок дважды отмывают в 15 мл дистиллированной воды центрифугированием, Надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 5 мл дистиллированной воды, добавляют 1 мл 0,1%-ного метиленового голубого и оставляют на 5 мин. Для удаления избытка красителя к смеси добавляют 10 мл дистиллированной воды и центрифугируют при 2200 об/мин в течение 7 мин,после чего осадок ресуспендируют в дистил влированной воде в объеме 5 мл. В качествестабилизирующего агента используют 1%твин - 80, который добавляют в количестве 0,5 мл.Препарат сохраняет свою активность при 4хранении в условиях холодильника ( +8 -- 10 С) в течение 20 мес,/7 ример 1. Способ постановки реакцииторможения бентонитовой агглютинации(РТБа).Для индикации микробных антигенов используют искусственно инфицированные шигеллами Флекснера пробы воды, молока, овощей и фруктов, которые перед исследованием прогревают в водяной бане при 100 С30 мин, затем центрифугируют и в реакциииспользуют надосадочную жидкость.В РТБа применяют коммерческую агглютинирующую неадсорби рова нную дизентерийную сыворотку к шигеллам Флекснера(титр 1:2800), Опытным путем устанавливают ее оптимальное рабочее разведение, равное 1:64,Реакцию ставят в полистироловых пластинках в объеме 0,3 мл. К 0,1 мл исследуемой жидкости добавляют 0,1 мл рабочего разведения сыворотки, содержимое лунок перемешивают и оставляют в термостате на 1,0 - 1,5 ч при 37 С. Затем во все лунки добавляют 0,1 мл бентонитового дизентерийного диагностикума. Содержимое хорошо перемешивают и оставляют при комнатной температуре.Постановке реакции сопутствуют два контроля: контроль рабочего разведения сыворотки и контроль диагностикума.Учет результатов реакции проводят через 20 - 30 мин невооруженным глазом. Реакция считается положительной, когда частицы бентонита равномерно выстилают все дно лунки в виде круглого пятна голубого цвета. При отрицательной реакции частицы бентонита располагаются на дне лунки в виде зонтика с выраженным фистончатым краем с полным просветлением надосадочной жидкости,Данная реакция позволяет обнаружить 6 - 12 тыс, микробных тел в 1 мл исследуемой жидкости.С целью проверки специфичности РТБа, реакцию проводят с другими микробами: сальмонелла энтеритидис, шигелла Зонне, эшерихия коли, иерсиния псевдотуберкулезис, иерсиния энтероколитика. Положительных результатов с указанными антигенами в РТБа не получено.Исследования показывают, что чувствительность РТБа при использовании предложенного диагностикума размерами частиц составляет 6 - 12 тыс. микробных тел в 1 мл, а в случае применения известного 50 млн. микробных тел.Таким образом, РТБа характеризуется специфичностью и высокой чувствительностью, которая превышает чувствительность реакции торможения непрямой гемагглютинации на 5 - 6 порядков и сокращает время исследования в 7 враз. Результаты реакции хорошо воспроизводятся после неоднократного перемешивания содержимого лунок (встряхивание не мешает повторному воспроизведению реакции), это позволяет использовать предлагаемый текст РТБа для экспресс-диагностики в полевых условиях.Пример 2, Способ постановки реакции бентонитовой агглютинации (РБа).При постановке реакции используют агглютинирующую неадсорбированную дизентерийную сыворотку к шигеллам Флекснера и Зонне,Сыворотку инактивируют в водяной бане при 56 С в течение 30 - 40 мин. В полистироловых пластинках готовят серийные двукратного разведения сыворотки в физиоло952260 Формула изобретения Составитель С. Малютина Редактор Л. Лукач Техред А. Бойкас Корректор Г. Огар Заказ 5833/8 Тираж 714 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб д. 4/5 филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4гическом растворе (рН 7,2) в объеме 0,1 мл. В каждую лунку добавляют по 0,1 мл бентонитового диагностикума, смесь тщательно встряхивают и оставляют при комнатной температуре, Реакцию сопровождают постановкой контроля на отсутствие спонтан ной агглютинации суспензии.Результаты реакции учитывают невооруженным глазом через 20 мин. Реакция считается положительной, когда частицы бентонита располагаются на дне лунки в виде зонтика (так же как и при обычной реакции непрямой гемагглютинации), с выраженным фистончатым краем и полным просветлением надосадочной жидкости. При отрицательной реакции частицы бентонита равномерно выстилают все дно лунки в виде пятна голубого цвета. Для проверки специфичности РБа ставят реакцию с неадсорбированными сыворотками к шигеллам Зонне, Титр 1:3200 (в случае использования антигена из шигеллы Флекснера); к шигеллам Флекснера, титр 1:12800 (при использовании антигена из шигеллы Зонне; к сальмонеллам энтеритидис, титр 1:1300; к псевдотуберкулезному микробу, тит 1. 1:12800.Неспецифические реакции отмечены только с сыворотками к шигеллам Зонне в раз ведении 1:8 - 1:16 (специфический титр 1:3200).В сравнении с чувствительностью аналогичной реакции, поставленной по известному способу, предлагаемая РБа оказывается эффективнее на 7 - 8 разведений сыворотки 30 (1:262144 и 1:256).Чувствительность Рба при выявлении антител в 10 раз превышает чувствительность сухих и жидких эритроцитных диагностикумов. Так, положительные результаты РБа с сухой ослиной неадсорбированной сыво роткой к шигеллам Флекснера (титр 1:12800, серия 221) наблюдаются в разведения 1:131072 - 1:262144, в то время как в РНГа только в 1:6400 - 1:12800.Таким образом, РБа с использованием бентонитового диагностикума характеризуется специфичностью и высокой чувствительностью. Для проведения этой реакции не требуются термостатные условия, время исследования сокращается в 7 - 1 О раз по сравнению с РНГа.Результаты реакции хорошо воспроизводятся повторно, после энергичного встряхивания содержимого лунок.Диагностикум для проведения реакции бентонитовой флокуляции характеризуется специфичностью, высокой чувствительностью, превышающей чувствительность известных диагностикумов на 7 - 8 порядков, позволяет сократить время исследования в 7 - 10 раз и может быть использован для экспресс-диагностики дизентерии в работе бактериологических лабораторий санэпидстанций. Способ получения диагностикума для проведения реакции бентонитовой флокуляции путем адсорбции антигена или антител на частицах бентонита при инкубировании смеси с последующей отмывкой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности реакции, для адсорбции используют частицы бентонита размером 0,0006 - 0,0009 мм в концентрации 1,7 - 1,8 мг/мл воды. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. К. %а 11 асе е( а 1, ТЬе вептоп 11 е Носсца 11 оп 1 ез 1 1 п Фе аззау о( ЯеЬзег 1 а апбвос(р, 1970, 16,8, р. 655 - 659.