Способ оценки биологической доступности ферментов

(51) 5 СА БРЕТЕН ицин- ьковв-Ашин ьковремендования ся повышение огической до- карственных спользовании ется предвавый гель ката- субстрата и унки геля ле, осуществляиндикацией ата и выявлепо контрасту ОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР) К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС(71) Казанский государственный мсКий институт им. С.В.Курашова и Хский фармацевтический институт(56) Тенцова А.И., Грецкий В.М. Сонее аспекты производства и исслемазей. М.: Медицина, 1982, с, 161,(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ДОСТУПНОСТИ ФЕРМЕНТОВ(57) Изобретение относится к биоформации и может быть использовано при оценке биологической доступности ферментов. Целью изобретения является повышение точности способа оценки биологической до-. ступности ферментов из лекарственных Изобретение относится к биоформации может быть использовано при оценке билогической доступности ферментов. Целью изобретения являет т(1 чности способа оценки биол с 1 упности ферментов из ле фрм.Поставленная цель при и заявляемого способа достига рйтельным введением в агаро лйтически расщепляемого пОследующим внесением в л к 4 рственной формы вещества ющего его расщепление, с процесса расщепления субстр нием получаемых продуктов форм, В опаровый гель вносят каталитически расщепляемый субстрат, затем разливают его в стерильные чашки Петри, делают лунки и помещают образец контрольной и испытуемой лекарственной формы, а индикацию осуществляют по контрасту прозрачной зоны и зоны прецинитации, содержащих расщепленный и нерасщепленный фермент. Заявляемый способ, отражающий зависимость каталитической активности ферментов от состава его носителя в лекарственной форме, позволяет охарактеризовать носитель фермента с биофармацевтических позиций и осуществить выбор оптимального носителя фермента в лекарственной форме в зависимости от способа ее применения, что, в отличие от прототипа, обеспечивает существенное повышение точности способа оценки биологической доступ ности ферментов, 3 ил., 2 табл. зон, содержа,их расщепленныи и нерасщепленный субстрат.Способ выг лняется следующим образом.К расплавленному и охлажденному до 37 - 40 С агаровсму гелю, выполняющему функции модельной среды, примешивают водный раствор сстрата, жидкую смесь разливают в стерильные чашки Петри диаметром 38 мм. В центре каждой чашки в застывшем геле делают по одной стандартной лунке диаметром 6 мм и помещают в нее образец контрольной испытуемой лекарственной формы. Далее все пробы термостатируют при 37 + 0,2 С в течение различных временных интервалов. Высвобождение фермента из лекарственной формы в гельсопровождается реакцией фермент-субстрат, прекращающейся после нанесения на поверхность геля химического агента, обуславливающего визуальное разделение зон, содержащих расщепленный и нерасщепленный субстрат. Диаметр эой диффузии фермента измеряют при помощи микроскопа с микрометрической шкалой и проводят статистическую обработку результатов с использованием критерия Стьюдента согласно требованиям ГФ СССР Х 1 издания,Степень абсолютного высвобождения (САВ) (биологической доступности) фермента из лекарственной формы рассчитывают отдельно для каждого временного интервала по формулеСАВ опытн 1 00% с 1 контр. где бопытн - диаметр зоны диффузии фермента из испытуемой лекарственной формы в гель (мм);с 1 контр - диаметр зоны диффузии фермента из водного раствора в гель (контроль) (мм),П р и м е р 1. Способ оценки биологической доступности бактериальной рибонуклеазы (рибонуклеазы Вас 111 цэ 1 псегщес 11 цэ) из лекарственных форм (мази 1 - 5 и водный раствор),Содержание бактериальной РНКазы в мазях и водном растворе 0,5 о . Состав мазевых основ представлен в табл.1.Агаровый гель, содержащий 0,2% субстрата (РНК), разливают в стерильные чашки Петри, Влунки контрольныхчашек помещают по 22,5 мкл 0,5 о -ного раствора РНКаэы, в лунки опытных чашек - по 0,0225 г 0,5% мазей РН Казы (1 - 5). Все пробы термостатируют при 37 + 0,2 С в течение различных временных интервалов. Далее на поверхность геля наносят на 5 мин 0,75 -ный раствор уранилацетата в 25% хлорной кислоте, охлажденный до 5 С, При этом непрореагировавший с РН Казой субстрат (РН К) образует преципитат, а зона каталитически расщепленного субстрата, т.е. зона диффузии РН Казы в гель, остается прозрачной в силу того, что мелкие фрагменты РНК (моно-пентануклеотиды), образующиеся при ее гидролизе, являются кислоторастворимыми.На фиг.1 представлены результаты, отражающие динамику высвобождения бактериальной рибонуклеазы из мазей и водного раствора в гель. При этом в контроле и опыте в случае использования мазей 3 - 5 уже через 1 ч вокруг лунок с лекарственной формой образовалась четко выраженная про 5 10 15 20 25 30 35 40 4550 55 зрачная зона, увеличивающаяся со временем, Для мазей 1 и 2 видимое невооруженным глазом наличие нечетко выраженных прозрачных эон отмечалось начиная лишь с четвертого часа эксперимента и по величине они значительно уступали результатам в контроле.Результаты микроскопирования образцов представлены в таблице 2. Они свидетельствуют о том, что для всех временных интервалов САВ бактериальной РНКаэы из мазей 3 - 5 на 10 - 20 выше, чем из мазей 1 и 2, причем к 6-у часу наблюдается отсутствие достоверных различий в сравнении с контролем не только для мазей 4 и 5, что было отмечено при визуальном анализе, но и для мази 3, Наличие четко выраженных прозрачных эон, граничащих с зонами преципитации в случае мазей 3 - 5, свидетельствует о том, что в течение заданного времени происходила диффузия фермента в гель, сопровождающаяся одновременным протеканием реакции фермент-субстрат,В то же время нечеткость и размытость границы прозрачной зоны с зоной преципитации в случае мазей 1 и 2 свидетельствует о вялости протекания процесса диффузии, т.е, о малой биологической доступности РНКаэы из мазей данного состава, что также можно оценить количественно, Очевидно, что в мазях 1 и 2 мазовые основы достаточно прочно удерживают фермент и очень медленно его высвобождают, что не всегда оправданно с терапевтической точки зрения,В последующие 8 ч, как свидетельствуют результаты, представленные на фиг,1 и в таблице, продолжалось высвобождение бактериальной рибонуклеазы из всех анализируемых мазей, причем также с явным преобладанием диффузии фермента из мазей на основах 3-5.П р и м е р 2, Способ оценки биологической доступности панкреатической РНКазы из лекарственных форм (водный раствор). Методика проведения эксперимента и вид использованного субстрата (дрожжевая РН К) идентичны методике и субстрату, приведенным в примере 1. Фиг.2 иллюстрирует результаты диффузии панкреатической РНКазы из 0,5%-ного водного раствора в модельную среду с различным содержанием субстрата, выражающиеся в наличии двух зон с наиболее четко выраженными результатами при содержании в модельной среде субстрата в концентрации 0,2,П р и м е р 3. Способ оценки биологической доступности панкреатической ДНКазы из лекарственных форм (водный раствор). Методика проведения эксперимента идентична методике, приведенной в примере 1,1802319 ступности ферментов. Так в случае использования заявляемого способа на примере 1 показано, что мази бактериальной рибонуклеазы 3-5 целесообразно испольэовать с 5 целью оказания ферментом резорбтивногодействия, а мази 1 и 2 рационально применять местно.Учитывая, что большинство ферментовимеют свой специфический субстрат и для 10 многих из них существуют методы индикации субстрата или продуктов его расщепления, заявляемый способ может быть с успехом применим при биофармацевтическихисследованиях лекарственных форм, содержащих 15 любые ферменты в силу его методологической универсальности, но при этом и строгой специфичности. Формула изобретения 20 Способ оценки биологической доступности ферментов путем введения их лекарственных форм в лунки агарового геля с последующей индикацией ферментов по изменению субстрата, о т л и ч а ю щ и й с я 25 тем, что, с целью повышения точности способа, в агаровый гель перед введением ферментного препарата вносят каталитически расщепляемый субстрат, а индикацию осуществляют по контрасту прозрачной зоны 30 и зоны преципитации, содержащих расщепленный и нерасщепленный субстрат,Таблица 1 Степ бсолютного высвобождения бактериальной рибонуклеозы (СА 8) из мазе, Мазь менной инте вал. 18 64,77 ,92(ч)70,56 Ю 27(ч) 89,009,8790,05,92 58 776,79(ч)53,0713,0675,881,89(ч)84,21 .14,20(ч)89,47 Ы 27 73,08 5,34(ь) 76,87 ,97(ч) 85,24+ 6,44 90 66.4.75(ч) 96.86.9270 26+ 67 Б 9 92 .6 51(ч) 81,40+8,73(") 62.4 9,44(ь)95 02 м 70 75 26 7799.046,67 80,36 м,16 99,04 1.3380,85,13Б 8 047 49(ч)71,57+11.1575.49" 6,9180.78 ,6784.71 .9266,84,92 70 67,19 .6,57 73 79,398 78 80.7,0 83 84.21.61868 Я 16 1 Я 16(") 4 .7.57(ч) 7.5 1 1+6.122 3 4 5 4,76+8,0 2,37.0 9.74+492,31и м е ч а н и е;- различие результатов в опыте и контроле статистически достоверно (Р 0,05) Однако в качестве субстрата для ДНКазы, вводимого в модельную среду, использована натриевая соль дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК натриевая соль) из эритроцитов цыплят. Фиг.З иллюстрирует результаты диффузии панкреатической ДНКаэы из 0,5-ного раствора в модельную среду с различным содержанием субстрата, практически не отличающиеся от результатов, полученных в примерах 1 и 2.Вышеперечисленные примеры подтверждают целесообразность использования разработанного способа для оценки биологической доступности каталитически активных веществ на основании данных о степени и скорости высвобождения фермента иэ лекарственных форм. Биологическая доступность фермента при этом можетбыть определена количественно, по величине САВ.Таким образом заявляемый способ, отражающий зависимость каталитической активности фермента от состава его носителяв лекарственной форме, позволяет охарактеризовать носитель фермента с биофармацевтических позиций и осуществить выбороптимального носителя фермента в лекар ственной форме в зависимости от способа , ее применения, что, в отличие от прототипа, обеспечивает существенное повышение точности способа оценки биологической доТаблица 2личных временных интервалах зкспозиции1802319 Составитель Л.ПоцелуеваТехред М,Моргентал Корректор П.Гереши бченко еда ктор зводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина,каз 847 ТиражВНИИПИ Государственного комит113035, Москва Подписноепо изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР