Способ количественного определения каталазы в молоке и других биологических жидкостях

нанс еитио-., , И СА"-)Й И".,%.1)вОБРЕТЕН ИЯ Союз Советски О циалистическ Республик(43) Опубликовано 3 Государственный комет Совета Инннстроа ССС оо делам изобретений н открытий(45) Дат бликования опи ИностранцьКарл"Густаф Р (Швеция) Авторыизобретени нст Андерс и Хеле нанна Росен Иностранная фирм(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО О В МОЛОКЕ И ДРУГИХ БИОЛОГИЧЕ ДЕЛЕНИЯ КАТАЛАЗЬИХ ЖИДКОСТЯХ 1 зооретение относится к технике определения колицественного содержания фермента каталазы в молоке и других биологических жидкостях, например, таких как кровь, сыворотка и тли1 звсстен способ количественного определения каталазь в молоке и других бпологицеских жидкостях путсм введения вагентов пс роксидазы, перекиси водорода, лсйкокраситсля, окисления лсйкокрасителя перекисью водорода в присутствии катализатора - перокспдазы, установления оттенка цвета в результате происходящей цветной реакции, щ которой судят о количестве каталазы и о кацественном составе анализируемого продукта 11.Недостатком известного способа является то, что процесс количественного определения каталазы в молоке и других биологических жидкостях сложен, а качество определения недостаточно высокое, поскольку в известном способе не обеспецивается возможность диффундирования образучогцейся перекиси водорода через жичкость, подвергаемую анализу на катализу, из фермента, образуюгцего перекись водорода, в систему, образующую краситель и содержашхю в основном катализирующий фермент.(21) 1 999885/28-13 (51) Кроме того, по известному способу невозможно определять небольшие количества катализы, т,е. выявлять заражение маститом в начальной стадии заболевания.Цель изобретения - упрощение процесса и повышение качества определения.:.)то достп) ается тем, что в предлагаемом сносе к колицественного опредсления катализы в молоке и других биолоп)ческих жидкстих в анализи 1) еммк) жидкость, со 1 с р)кагцх к псрокспдазу и лейкокраситель, вводят галактозоокспдазу или д-галактозидазу и глюкозооксидазу или Л-галактозидазу и галактозооксидазу, продуцирующие перекись водорода непосредствен)ю в анализируе мхю .кпдкость.При этом анализ количественного определения каталазы проводят с пох)огнь о фильтровальной бумаги, на которой находится пероксидаза и лейкокраситель, отделенные от фермента илп синергетичес;их ферментов, способных выделять перекись водорода.Способ осугцествляют следуюгцим образом. В оиологическую жидкость, например мочоко, вводят реагенты - перокспдазу, переспсь водорода и лейкокрасптель. В анализпруемую жидкость. содержацую пероксила лейкокрясптель, доно;1 нпт.лыо вводятфермент илп синсргетические ферменты, дк 1 с 1(як 1 алдктозоокслазу 1 ли Д-Гс.15 кс)зп.5дазуглюкозоокснлазу нлп /3-галдктозл 11- зу и гдл д к зоокснлсзу. пролуцирующпс нерекВсь Водорода непосредственно в ана.1- зпруемую жнлкость.1 е 1 кок 1)дс 11(,ь Окнс,яют перс.нсыо ВОлорола В присутствии катализатора пе- О роксидазы, н по происклящей цветной реакции судят о количестве каталазы и о качественном составе анализируемого продукта.15,огчественпый анализ каталазы проводят при помощи фпльтровальной бумаги, на одной стороне которой помешают пероксидазу и лейкокрасптель, отделяя их от фермента ли спнеретических ферментов, способных выделять перекись водорода.Прн отсутствии в анализируемой 5 клкостн кдталдзы раствор имеет темно-гол) бой нли зеленый цвет, а в случае ее высокой концентрации - бледно-желтый цвет. Чувствительность определения обратно пропорционалыд концентрации пероксидазы В реакционной смеси.25В случае анализа молока, взятого от коров, зараженных маститом (степень зар(1 жс- ния возрастающая), цветная реакция приводит к ОорязованО жидкого прод кта, 1 меющего цвет от срелне-голубого до слабо-желтого.30При определении каталазы одну,капломолока перемешивают с одной каплей реакционного раствора, приготовленного В) Олному из следующих составов, мг/мл:1. ф- Гал а ктоз ила за 0,1 35Г.юкозооксилдза и.нгалактозоокснлдзд 0Пероксида за 0,1о-Толилин 0,211. Ге),1(1 ктозооксил(135Пероксндаза 0,1О-ТОЛЛИН 0,2111. Гппоксднтнн О,Пероксплаза 1,0О-Тол ид 5 н 0,21 Ч. Перборат натрия и.и45ПЕРОКСИД МОЧЕВИНЫ 1,0Пероксплазд 1,0о-Толидин 0,2Одним нз этих составов пропитывают полоску фильтровальной бумаги и высушивают, затем вносят в молоко, предназначенное 50 для анализа на содержание в нем каталазы.При этом полоска фпльтровальной бумаги абсорбирует определенное количество молока, соответствующее количеству реагентов, находящихся на бумаге. Используемая в указанных составах пероксилаза может иметь соответствующую промышленной степень чистоты. Глюкозооксидаза и галактозидаза должны быть приготовлены пригодными для анализа невысоких концентраций каталазы.Для обеспечения устойчивости реагентов онн 60 лол 5 кны быть растворены в соответствуюгцембуферном растворе с рН 7.Пример 1. Испытательную ячейку разделяют на две секции, одну из которых закрыВдОт полупроницаемой мембраной, при этомоа содержит 1 - 101 галактозооксилазы (врасчете на лактозу, являющуюся субстратом) . В открытую секцию испытательнойячейки добавляют 0,5 - 1,0 мл жидкости,подвергаемой анализу на содержание каталазы. Испытательную бумагу, содержащуюпероксидазу и лейксжраситель, помещают вжидкость так, что расстояние от самой близкой части испытательной бумаги ло полупроницаемой мембраны составляет несколько миллиметров. Различная чувствительность анализов на каталазу зависит от количества галактозооксидазы, объема пробыи расстояния между фильтровальной бумагой и полупроницаемой мембраной,При анализе молока на каталазу получают полуколичествснные данные О концентрации последней в пределах примерно от 2до 20 Ч/мл путем сравнения цвета на испытательной бумаге с цветным эталоном. Интенсивное окрашивание наблюдают через несколько минут при условии отсутствия катдлазы и более слабое - при высоких концентрациях каталазы.Пример 2. Систему, в которой образуетсяперекись водорода, помещают В олпу секциюиспытательной ячейки, а систему с образованием красителя - в другую секцию, обесистемы разделяют пористым элементом, образующим разделяющее пространство (среду). Этот пористый элемент может аосорб 1 ровать жидкость, подвергаемую анализу накаталдзу, и обеспечивает диффузию черезсебя перекиси водорода. Это разделяюцеепространство может быть усилено гОлупроницдемой мембраной или несколькими слоямп пористой бумаги,Этн лвс системь рс 1 сгон нс но,.з 1 ОтТЯКЖ. В С,105 Х ГСЛ 5.Готов 51 т лВЯ 1)аствор( 1 р О С В 20 - 40"/о-ном желатине плп лругом гелеооордзу 1 ощем веществе.Раствор 1: пероксилаза (ЕС 1.11, .7,РХ = 0,6 0,5 мг/мл; оолилин0,5 мгмл; Буферная соль, обладаюгцая нейтральным водородным пока.зателем рН 7, например фосфат.Раствор 2: галактозооксидаза (ЕС.13.9, около 20 Ч/мг в расчете на лактозу, являющуюся субстратом и несодер )к а ш ю катал азу) 0,5 -5 О мг/мл; буферная соль, как врастворе 1.Пример .). Вместо системы двух ферментов, находящихся по обе стороны пористого элемента и помещенных в различные слоигеля, используют два пористых элемента нзбумаги, прп этом одна из систем алсорбп;руется в другую на обе стороны илп в различные части третьего пор 5Того элемента,пзОтовле(ноо также из оумаги. Эп дваГ 22423 Фг)1,п),и ггзггетг ни;с Гостами.сд, Л. Ьражиикои Редактор Н. Х)тз)дров 1 сккд Г)1) говги Коррскор Е. Гдии Заказ 4728 1 ира.к" 11 одииснс ПНИИПИ ос) дарствеиого кити) сга ,овстд Министров СССР по лсзам изобретг ния и открытии 113035, Москва. гж 35, Рушек;д иаб., гк 4 5 влив,з 11 ПГ 1 Пдтсит, г. Укзро.г, уд. Про л ваи. 1пористых элемента изглир) т с внутреннего элемента при помощи полупроницасмых мембран.Лример 4. Согласно примеру 2 готовят два раствора и помешают их в микрокапсулы, которые затем размещают в разлгчных слоях по каждую сторону пористгго диффузионного слоя или смешивают с инертной лиф)узионной средой, например волскиами цсллолозы, получая при перемсшивании пористчю структ ру.1 ОПредлагаем ьй спосоо количественного определения каталазы в мглгке и других био.огичсских килкост 1 х ио ср 1 висни) известным обеспечиваст упрощение процесса и повышение качества определения.15Чувствительность однофазной системы реагентов лостаточно высока для определения воспалительного процесса, происходящего в молочных железах, а также для илентифицироваиия стадии его развития. Однако она нс обладает лостаточюй чувствительностью 20 для надежного. определешя заболевания на ранних сгадиях (воспалительный ироцесс - субклинический мастит). Но эти стадии могут быть идентифицированы фотометрическими методами, и в этом случае могут быть успешно использованы олнофазные системы реагентов.Чувствительность аналитического метода может быть увеличена ло необхолимого уровня при использовании многофазной системы, когда реагенты, образующие перекись водорола и краситель, разлеляют физически некоторым пространствам (или средой), через которое образуошаяся перекись водорода может диффундировать, причем указанное пространство может содержать и анализируемое молоко. За время прохождешя перекиси водорода из фазы реагентов, образмюиих перекись водорода, через разлелякщес пространство и вхг)да в фазу реагслов, Образукцпх краситель, она полность или частично разлагает каталазу, пахи.ярдугся и х олокс и проикпуг или введеннуо в указапщс пространство.. Сшсоб кг,ичсс) венного Определения 11 тагазы ь молос и лрих Оиологических жилкостях пхтем введения реагс 1 тов пероксилазы, перекиси вгдород 1, лейкокрасителя, Окисления лейкокрасгеля перекисью нолорола в присутствии катализатора - пероксилазы, установления Оттенка цвета в резульгате прогсхолящей цветной реакции, по ко ОРОЙ СУЛЯТ О КГГпгССВС Ката;1 аЗЬ И О Качественном составе анализируемого продукта, от,11 игающигс) тем, что, с целью упрощения процесса и повышения качества определения, в анагизируемую жидкость, солсржа 1 цую псроксидазу и лсйкокраситель, дополнительно вволят галактозооксилазу или /3-галактозилазу и глюкозооксилазу или Д-галактозилазу и галактозооксилазу, продуцирующие перекись водорода непосредственно в анализируемую жилкость.2. Способ по п. . отличаюи 1 гися тем, что анализ количественного определения каталазы проволят с помощью фильтровальной бумаги, на которой находится псроксилаза и лейкокраситель, отделенные от фермента или синсргетичсских ферментов, способных выделять перекись волорода.Гриоритет по пунктам;16.02.73 по и. 1;19.07.73 по п. 2.1 Лсточники информа 1 ци, принятые во внимание при экспертизе:1. Х. р 1)5 г. Ссп 1., 1962, 32 с), с. 40.