Способ определения состояния клеточного иммунитета организма

(19) И 1) 3(51) А 6 0 00 г ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ов ательс эпидемиоетоды.Мир,ИЯ СОСТОЯ- ОРГАНИЗМА в из крови ОСУДАРСТНЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ ОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Одесскийнаучно- исслкий институт вирусологиилогии им. И,И.Мечникова(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕННИЯ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТАпутем выделения лейкоцито сенсибилизированного организма споследующим заполнением капилляроввэвесью. лейкоцитов, культивированием)их в питательной среде и измерениемэон миграции лейкоцитов под действием специФического антигена, о тличающийся тем, что, сцелью повышения точности определениясостояния организма при гриппе,лейкоциты предварительно выдерживают с вируссодержащей аллантоиснойжидкостью,для заполнения капилляровиспользуют образовавшийся осадок лейкоцитов с адсорбированным вирусом.Изобретение относится к областимедицины.Известен способ определениясостояния клеточного иммунитетаорганизма путем выделения лейкоцитов иэ крови сенсибилиэированногоорганизма с последующим заполнениемкапилляров нэнесью лейкоцитов, культивированием их в питательной средеи измерением зон мит рации лейкоцитовпод дейстнтем специфического антигена Я,Однако известный способ не позволяет точно определить состояние пригриппе.Целью изобретения является повы-.шение точнОсти Определения состоянияорганизма при григпе,Цель достигается тем, что т:опредлагаемому способу определениясостояния клеточнот.о иммуниета органиэма путем выделения лейкоцитовиэ крови сенсибилизированного органиэма с последующим заполнение капилляров нэвесью лейкоцитов, культивироаханием их в питательной среде и измерением зон миграции лейкоцитов поддействием специфического антигеналейкоциты предварительно вь 1 держиваютс вируссодержащей аллантоисной жидкостью, для заполнения капилляровиспользуют образовавшийся осадоклейкоцитов с адсорбированным вирусом,Способ осуществляют следукщимобразом.Вирус гриппа (неочищенную и неконцентрированную нируссодержашуюаллантоисную жидкость с титрсгемагглютининов 1:25 б) добавляютне в среду культиниронания клеток,а к взвеси лейкоцитов епосредстДнЕнно после их выделения,. Смесь инкубируют гри 4 С н течение 30 миндля адсорбции вируса на лейкоцита .,надосадочную жидкость удаляют послецентрифугирования н течение 1 0 мипри 800 об/мин, Полученньп осадкомклеток заполняют капилляры с ннутренним диаметром О,б мм и помещают нкамеры со средой 199 и 14 альбуминачеловека, инкубируют при 37 С в течеу Ъние 24 ч, определяют площади мигра - з 0ЦИИ КЛЕТОК В ОПЫТЕ (ЛЕйКОттитЫ + ВИрус) и контроле (лейкогтитьт без вируса). По их отношению (индексмиграции судят о степени сенсибили"зации организма к антигенам вируса 55гриппаСоотношение лейкоцитов и Ви-руса гриппа оптимально при добавлениик б 10 клеток 2 мл нируссодержащейаллантоисной жидкости с титром гемагглютининон 1."256.П р и м е р. Лейкоцить выделяютиз 15 мл гепаринизиронанной кровилюдей добавлением 2 мл ЗЪ-ной желатины. Через 15 мин после осажденияэритроцитон ПЛазму со взвешенными клетками переносят в центрифу;:ыепробирки, центрифугируют 10 мин при800 об/мин р к Осадку клеток Длялиз иса зритроцитов,цобавляют 5 млхолодного 083-ного раствора хлористого аммония (НН 4 СР), тщательноперемешивают снова центрифугируютпри тех же ларамтрах и однократноотмывают 5 мл холодного забуференного физиологического раствора(рН - 7,2). Осадок клеток делят надне равные части, Одна из них используется для заполнения капилляров,которые помещают н контрольныекаеГы. Ко второй части клеток добанляют 2 мл вируссодержащей аллантоисной жидкости с титром гемагглютининов 1:25 б (вирус гриппа А/Ленинград 0139/7 б (Н.- Я) смесь инкубиру-.ют при 4 С н течение 30 мин центрифигурируют 10 мия при 800 об/мин, надосадок голностт з удаляют, а взвесьюклеток с адсорбированныМ на нихварионами заполняют капилляры, которые помещают в опытные камерь 1, Пе.ред внесением капиллярон н камерыодин конец его эапаивают, капиллярыцентрифугируют 5 ми при 800 об/мини обламывают ниже границы слоя клеток Отрезок капилляра с клеткамиукладь:вают на дно камеры запаяннымконцом и каплю стерильного вазелиноного масла, Контрольные и опытныекамеры заполяют средой 199 с 1%альбумина челоне;а и антибиотикамибез атигена, На поотяжении всегопериода поставки реакции, начинаяс момента выделения и до внесенияв камеру со средой, клетки сохраняктгся на холоду ( в банках со льдом), ав момет разрезания капилляров ихпоме 1 ают в чашки Петри, которыекладут на лед,герметически закрытые камеры инкубиуют = течение 24 ч при 37 С.оЦля одого исследования используют4 котрольных и 1 опытных капилляра,По окончании сро а инкубации спомощью Фотоувеличителя регистрируютплогладь маграции клеток в опытныхи контрольчых камерах, Зону миграциивырезают и взвешивают на торэионныхвесах, )тндекс миграции нычисляют:где ос - соедний вес лошадей миграции под влиянием вирусаГРтППа, Р - СРЕЦНИй ВЕС В КОТРОЛЕ.В таблице приведены результаты параллельного определения состояния клеточного иммунитета (ГЗТ) у людей, привитых инактивиронанной гриппозной АГХ-накцтиной иэ штамма вируса гриппа А/Ленинград/0139/7 б/, через 20 дней после двукратного введении препарата в прямом капиллярном тесте в предлагаемой модификации и при постановке919179 Номер исследоваВ среду культивирования (известный способ) К лейкоцитам(предлагаемый способ) ния 0,5Л 0,5 0,6 0,2 0,6 0,1 0,9 0,3 0,7 0,2 0,7 Среднее 0,66+0,05 0,26+0,05 Составитель С.МалютинаРедактор Л,утехина Техред Т,Маточка Корректор И.Эрдейи Заказ 10693/6 Тираж 713 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д.4/5 Филиал ППП Патент, г,ужгород, ул.Проектная, 4 известным. способом. В известном способе в среду культивирования добавляли вирус гриппа, очищенного сорбцией-, элюцией на куриных эритроцитах и сконцентрированного центрифугированием при 20 тысячах об/мин в течение 2 ч на центрифуге ЦВР, конечный титр гемагглютинина в среде культивирования был равен 1:256.Как видно из данных, приведенных в таблице различия в уровне тормо (жения миграции лейкоцитов под влиянием вируса гриппа А 2 при использовании предлагаемого способа по сравнению с известным, статистически, достоверны (р ( 0,001) и подтверждают большую 15 точность предлагаемого способа (индекс торможения миграции в известном способе - 0,66-0,05, а в предлагаемом - 0,260,06).Добавление к лейкоцитам алланто исной жидкости незаряженных куриных эмбрионов не влияло на показатели реакции, различий по сравнению с контролем не отмечено.При исследовании с помощью предлагаемого способа ГЗТ у привитых через 10 дней после повторного введения вакцины наблюдали резкую ингибицию миграции (индекс торможения миграции составлял 0,05). В отдален- ЗО ные сроки (3-6 месяцев после иммунизации) индексы повышались до 02- 0,7. При изучении ГЗТ известным способом индексы миграцйи колебались от 0,5 до 0,7, независимо от срока, прошедшего после прививки. Следовательно, с помощью предлагаемого способа более точно удается определить состояние клеточного иммунитетау людей, сенсибилизированных к антигенам вируса гриппа,Индексы торможения миграции лейкоцитов, привитых гриппозной инактивированной вакциной из штамма А/Н М /, при использовании известного и йредлагаемого способа Показатель торможения миграциилейкоцитов при добавлении вируса Л/Н Н / Х- индекс торможения миграции.