Способ получения фибринолитического фермента

Союз Советски кСоциалистнческнкРеспублик АВТОРСК СВИДЕТИЛЬСТВУ нительное к авт. свид-ву -(5 )М. Кл.С 12 й 9 2)Заявлено 24.06.80 (2 присоединением заявки М 2945300 28 дарствеииый кемите СССР 23) Приоритет Опубликовано 23,02.82. Бюллетень М по делам изебретеии и аткрытий 53) УДК 577. (088.8) Дата опубликования о сания 23,02.82.(72) Авторы изобретения Н,Н.Фалина, Н.П.Денисова, Н.Н.Петрищев и Н.В.П 71) Заявитель отанический институт им. В.Л.Комаро 3 54) С 11 ОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТАн ч льзованы в которые могут быть ных ине очестноше вие 1 Изобретение относится к произ ству ферментов, в частности к по нию Фибринолитических Ферментов,Известен способ получения Фибрннолитического фермента из баэидиального гриба Агв 111 эг 1 а пе 11 еэ, заключающийся в обработке плодовыхтел грибов водой при 2 С и извлече,о,нии водного экстракта вещества, содержащего фермент. После этого прирН 6,0 дважды этиловым спиртом илидругим органическим растворителем,смешнвающимся с водой, осаждают приминус 5 С АМ-протеазу. Очистку протеаэы ведут ионообменной хроматографией и гельфильтрацией. Полученный фермент лиофилиэуют. Способ позволяет получить фермент, обладающийспособностью к разрушению фибринаи вызывающий антикоагулирующее дейОднако ограниченность ассортиме та исходного сырья и трудоемкость извлечения из него фермента, а такж отсутствие отечественных фибрино тических препаратов иэ базидиапь грибов заставляет предпринимать и иски новых путей получения фибринолитического фермента иэ других родов съедобных грибов.Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту к предлагаемому является способ получения Фибринолитического фермента из плодовых тел базидиального гриба Тг 1 спо 1 оптэ Е 1 эчоч 1 гепв (Гг) цпде 11 ес Маппр синоним Т. едцеэйге (зеленушка)Способ получения фибринолити кого фермента заключается в том,о собранные грибы предварительносушивают, затем плодовые тела размельчают и суспензируют в физиологическом растворе при соо нии грибы: раствор, равном 1после чего проводят экстрагирование белков (инкубацию суспензии)при 37 С ь течение 2-3 ч, затем втечение ночи при комнатной температуре, Далее отделяют экстракт филь"трацией через марлю и повторно через Фильтр Шамберлена, .после чеговыделяют фермент в верхний слой центрифугированием, предварительно осветлив раствор добавлением 20 Х-ного уксусного цинка при соотношении 1:10, для того, чтобы удалитьбалластные пигментные вещества. Вы"деленный фермент диализуют противдистиллированной воды в течение нескольких дней и лиофилизуют 121Однако известный способ не позволяет получить достаточно высокуюактивность фибринолитического фермента из Тг 1 сйо 1 ова Гачоч 1 гепз, таккак на стадии экстракции при 3 Спроисходит частичная потеря биологической активности фермента и непредусматривается концентрация белков, содержащих фермент,Кроме того, известный способ длителен за счет стадии высушиваниягрибов и обработки больших объемоврастворов (1:1 О), а также их двойной фильтрации через марлю и фильтрШамберлена, что к тому же явл 9 сется трудоемкой операцией,Цель изобретения - повышение активности фермента, обладающего фибринолитическим действием. 5 10 15 20 25 30 35. 40 45 50 55водопроводной воды в течение трех суток (отсутствие ионов 0 проверяПостав. сенная цель достигается тем, что согласно способу получения фибринолитического фермента из плодовых тел баэидиального гриба рода Тг 1 сйо 1 оссса путем суспендирования плодовых тел, экстрагирования белков из суспензии, отделения экстракта и выделения из него фермента с последующим диализом и лиофилизацией целевого продукта, используют плодовые тела Тг 1 с 11 о 1 оаа рогФепйозссщ (Гг) 0 ое 1, экстрагирование.оосуществляют при 3-5 С в течение 12-14 ч, а выделение фермента прово" дят сернокислым аммонием до насыщения 0,75-0,80 в течение 1-2 ч. Проведение экстрагирования на хо. лоду при 3- С 1 созволяет сохранить фермейт в нативиом состоянии. В течение 12-14 ч происходит полное экстрагирование фермента. Вьсделение фермента из экстракта сернокислым аммонием позволяет сконцентрировать в осадке белки, содержащие фермент.При насыщении сериокислым аммонием от 0,75 до 0,80 осаждаются белки с фибринолитической активностью, тогда как при насыщении ниже 0,75 наблюдается потеря фермента, а выше 0,8 в осадок выпадают неактивные балластные белки, что загрязняет продукт и снижает его удельную активность. Шадящий режим осаждения в течение 1-2 ч, за которые полностью формируется осадок, способствует сохранению исходной активности нативного фермента, тогда как более длительная экспозиция осадка приводит к частичной необратимой денатурации белка, который теряет свою биологическую активность.Способ осуществляется следующим образом.Свежие плодовые тела ТгсЬо 1 ова рогСепйозссв суспензируют в физиологическом или забуференном физиологическом растворе (рН 7,0-7,2) при соотношении грибы: раствор, равном 1:38 после чего экстрагируют при 3-5 С в течение 12-14 ч, затем центрифугируют и супернатант осаждают сернокислым аммонием до насыщения 0,75-0,80, концентрируя фермент в осадке. Через 1-2 ч осадок отфильтровывают, растворяют в дистилли- Фрованной воде и диализуют в течение 2-3 дней сначала против водопроводной. воды, затем против дистилолированной при 4 С и далее лиофильно высушивают. П р и м е р. К 1 кг очищенных плодовых тел грибов Т. рогйепйозссссс, собранных в Минской области, добавляли физиологический раствор ( рН 7,2) в соотношении 1:3 и грибы размельчали в гомогенизаторе (РТ). Полученный гомогенизат оставляли на 14 ч,,опри 5 С для зкстракции фермента, после чего экстракт центрифугирова:ли (3,5 тыс. об/мин), осадок отбрасывали, а из экстракта высаливали фермент сернокислым аммонием до насыщения 0,8 ч в течение одного часа при 4 С, 8 атем осадок отфильтровываоли на бумажном фильтре и собирали. Полученный ферментативный белок растворяли в 40 мл дистиллированной воды и ставили на диализ против проточнойФермент, полученный по предлагаемому спосо бу 1:1 О 24 ермент, полученй по известому способу 1:16 аказ 519/34 Тираж 505 Подписное"Патент", г. Ужгород роектная Фил 5ли качественной реакцией с ВаС 1). Затем раствор фермента диализовали ,против дистиллированной воды в .течение 14 ч при 4 С, Отдиализованиый раствор Фермента лиофильно высушивали. Получили 1,5 г сухого Фермента со специфической фибринолитической активностью.Удельная фибринолитическая активность Фермента (по Аструпу) составляет 16850 ед., фибринолитическая активность (по Эстоло) - 1:.64, Фибриногенолитическая (по Эстоло) 1:1024. Из таблицы видно, что предлагаемый способ получения фибринолитического фермента из базиднального гриба Т. рогйепСозпе позволяет в 4 раза повысить фибринолитическую активность фермента, а Фибриногенолитическую активность в 8 раз по сравнению с известным.Кроме того, получаемый по предлагаемому способу Фермент, как видно из примера обладает, тромболитическим действием, что является особенно важным, учитывая отсутствие отечественных тромболитических препаратов не микробного происхождения.Высокая фибринолитическая активность полученного предлагаемым способом Фермента была подтверждена в экспериментах с плазмой крови ла" бораторных животных и в опытах 1 и ччоТаким образом, предложенное изобретение позволяет повысить активность Фибринолитического фермента. 90070 6Тромболитическая активность состав 1ляет 2,0 ч на 1 мг белка. Для сравнения активности фермен"та, полученного по предлагаемомуспособу, с активностью фермента, полученного по известному была.произведена оценка фибринолитической (ФА)и фибриногенолитической (Ф 1 А) актив- Оности по методу, описанному Эстолои другими. Результаты сравнения приведеныв таблице Формула изобретенияСпособ получения фибринолитического фермента иэ плодовых тел баэидиального гриба рода Тг 1 сЬо 1 оаа путем суспендирования плодовых тел,З 5 экстрагирования белков из суспензии, отделения экстракта и выделенияиз него фермента с последующим диаливом и лиофилизацией целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я4 О тем, что, с целью повышения активности фермента, используют плодовыетела Тг 1 спо 1 опа рогйепйозцщ.(Гг) Цце 1экстрагирование осУществляют при3-5 С в течение 12-14 ч, а выделе 45 ние Фермента проводят сернокислымаммонием до насыщения 0,75-0,80 втечение 1-2 ч,Источники информациипринятые во внимание при экспертизе1. Патент Франции Р 2070093,кл. С 07 Х 7/ОО, 1971.2. Гзсо 1 а ей а 1 "Аппа 1 ез вед 1"с 1 пае ехрег 1 яепса 11 э ес В 1 о 1 од 1 аеЕепп 1 аеф, 1955, ч. 33, У 4, р. 384-391,