Способ определения е-розеткообразующих клеток

ос ается тем, чт озеткообразующ путем смещен рана и лим ированием с фоцитов меси и Изобретение относится к медицине, аименно к иммунологии.Известен способ . определения Е-розет-"кообразующих клеток(Е РОК) путем смешения суспензий эригроцитов барана и лимфоцитов с последующим инкубированиемсмеси и подсчетом розеток (,1),Однако известный способ не обеспечивает точного определения Е-РОК изанежелательных изменений поверхностиэригроцитов барана фиксатором - неспецифического прилипания фиксированныхэритроцитов барана к клеткам крови человека и возможного обнажения в мембране бараньих эритроцитов скрытых антнгенов, к которым имеются рецепторы, улимфоцитов человека,Цель изобретения - повышение точити способа.Цель достиг о способ оп 20ределения Е-р их клетокосуществляют ия суспензийэригроцитов ба с последующим инкуб под м2перед смешением обгидом при конценгра,0% и ацетальдеги,0-7,2 и "20-25 С троциты цетальд итов 9,0при рН розеток, эрирабатывают ации эритроцда 7 е 20 ф 1%22-24 ч.Способ ос дующим сгвляю зом. фиксацИю эритроцигов осуществляют смешением равных обьемов 18% (по плотному осадку) взвеси отмытых 0,85%-ным раствором ЙаС бараньих эригроцигов и 7,2% раствора ацетальдегида, содержащего 0,85%-ную ЙаС 8 .(рН раствора ацетальдегида предварительно доводят до 7,0- 7,2 с помощью ЙаОН). Смесь выдерживают 22-24 ч при 20-25"С при периодическом перемешкрании. Затем эритроциты трижды отмывают 0,85%-ным раствором Й аСФ при ценгрифугировании ( 3 мин, 3 гыс. об/мин), Отмытые фиксированные эритроциты суспендируюг в 0,85%-ном растворе Н аС 6 до 10%-ной концентрации (по плотному осадку), Клеточную концентрацию взвеси определяют подсчетом8629в камере Горяева. Препарат фиксированныхэритроцитов барана хранят при 3-5 С беэконсерванта. фиксированные эритроцитысохраняют пригодность для определенияЕ-РОК в течение не менее 1 года (срокнаблюдения),П р и м е р 1. Выделение лимфоцитовчеловека производят в растворе, составленном иэ 10 мл 100/о-ного раствора желатина, содержащего 0,85 О/о-ную МаС 1, 10и 0,6 мл раствора гепарина (без консерванта) с активностью 5000 МЕ/мл. В0,5 мл приготовленного раствора берутиз вены самотеком 10 мл крови. Кровьотстаивают 30 мин при 20-25 ОС, Иэпробы крови лимфоциты выделяют в фиколл-верографиновом градиенте следующегосостава: 7 объемов 36,7% верографинаи 16 объемов 9% водного раствора фиколла, плотность градиента равна 1,077. На1 объем градиента в узкой центрифужнойпробирке наслаивают 2 объема надосапка,образовавшегося над слоем эритроцитов приотстаивании крови. Пробу центрифугируюг35 мин при 20-25, 1400 об/мин. Лимфоциты отсасывают из границы разделажидкостей, дважды отмывают средой199 5 мин при 20-25 ОС, 1200 об/мин.Концентрацию лимфоцитов определяют подсчетом в камере Горяева. Взвесь лимфоцитов разводят средой 199 до конечнойконцентрации 210 клеток/мл.6Дважды отмытые 0,85%-ным раствором йаС 0 и один раэ средой 199 фиксированные эритроциты суспендируют в сре.де 199 до концентрации 6-10 10 кле 35ток/мл, исходя иэ результатов определения концентрации эритроцитов в исходной 10 О/о-ной взвеси фиксированных клеток,0,5 мл полученной взвеси лимфоцитов ос 40торожно наливают на дно конической цент 1рифужной пробирки, к ней добавляют0,5 мл приготовленной взвеси фиксированных эритроцитов барана, Содержимое осторожно смешивают и оставляют 20 мин при37 С. Пробу центрифугируют 5 мин при500 об/мин при 20-25 С и оставляют наночь при 3-5 ОС. Затем содержимое пробирки перемешивают осторожным вращением в вертикальном положении 30 с. Пробу помещают в камеру Горяева и производят подсчет Е-РОК, принимая эа нихлимфоциты с не менее чем тремя плотно прикрепившимися эритроцитами, Вычисляютна основе не менее трех параллельных определений процентное содержание Е-РОК 55в общем количестве лимфоцитов.Для получения сравнительных данныхв контроле вместо фиксированных эрит 19 4роцитов применяют в тех же условиях наг ивные эритроциты барана, выделенные из свежей крови, собранной в раствор Олсвера. Полученные следующие результаты при определении Е-РОК (%) человека с эритроцитами: нативными - 32,8 ф 1,6; 38,2+1,0; 42,2+0,4; фиксированны ми 31,811,1; 34,60,9; 34,80,5.Приведенные данные показывают, что в реакции розеткообразования с фиксированными эритроцитами барана выделяются менее колеблющиеся показатели содержания Е-РОК по сравнению с применением в реакции нативных эритроцитов. При этом средние количества нагивных и фиксированных эритроцитов, приходящихся на одну Е-РОК, практически одинаковы. Существенно сокращается время на проведение анализа в результате гого, что концентрация фиксированных эритроцитов определяется подсчетом один раз для большой партии фиксированных эригроцитов.П р и м е р 2. Выделение лимфоцитов осуществляют так же, как в примере 1. С каждой из двух проб лимфоцитов человека, выделенных соответственно из крови двух доноров по способу, описанному в примере 1, четырехкратно определяют содержание Е-РОК с каждой из грех партий нагивных эритроцитов и с одним препаратом фиксированных по предлагаемому способу эригроцигов барана. Результаты анализа полученных данных сведены в таблицу.Как видно, содержание Е-РОК значительно колеблется для одной и той же пробы лимфоцитов в зависимости от особенностей нативных эритроцитов. Сравнение кюффициенгов вариации, вычисленных для нативных эритроцитов суммарно и для фиксированных эритроцитов, показало существенное (Р 4 0,05) уменьшение степени варьирования результатов определения Е-РОК при использовании фиксированных эритроцигов.П р и м е р 3. В параллельном опыте проверяют не изменяется ли специфичность выявления Е-РОК при использовании фиксированных по предлагаемому способу эритроцитов барана в сравнении с нагивными, Опыт ставят следуюшим образом.Две одинаковые пробы лимфоцитов, выделенных по методике примера 1, истощают бараньими эритроцитами: одну - нагивными, другую - фиксированными; количество эригроцитов, использованных дпя "истощения, одинаковое - 100 млн. эригроцигов на 20 млн. лимфоцитов. В надо- садках обеих проб в реакции роэеткооб8629 разования с нативными эритроцитами барана по тому же способу определяют ко-личество Е РОК. Получают следующие результаты: количество Е-РОК после "истощения" нативными эритроцитами снижается с 32,81,6 до 4,1+0,7; количество Е-РОК после "истошения фиксированными эритроцитами снижается с 31,811,1 до 3,4+0,2.Эти результаты показывают, что Е РОК человека одинаково реагируют с нативными и фиксированными эритроцитами.Проверка специфичности выявления Е-РОК с фиксированными эритроцитами 28 О+ 0,9рабатывают ацетальаегндом прн концентрации эритрацитов 9,031,0% и ацетальдегила 7 ф 2+Оф 1% при рН 7,0-7,2 и 20- 35 25 С 22-24 ч. Составитель С. Малютина Редактор Л. Повхан Техред Ж.Кастелевнч Корректор М. ШарошиЗаказ 7619/4 Тираж 690 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 формула изобретения Способ определения Е-розеткообразующих клеток путем смешения суспензий. эритроцитов барана и лимфоцитов с последующим инкубированием смеси и подсчетом розеток, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности ,способа, эритроциты перед смешением оббпутем микроскопии мазка, окрашенного по Браше, подтверждает специфичность выявления Е-РОК в реакции с фиксированными эритроцитами.Предложенный способ фиксации эритроцитов барана обеспечивает юС стабилизацию и пригодность для определения Е-РОК человека, При этом не изменяется специ фичность выявления Е-РОК. Способ обеспечивает снижение вариабельности результатов определения Е-РОК человека нама особенностей различных партий нативных, бараньихэритроцнтов и их нестойкости, а также экономию времени на подсчет ксоцентрации эритроцнтов в каждой партии. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. фримель Х. Иммунопогические методы. М., "Мир", 1979, с. 503.