Ферментный электрод для опреде-ления глюкозы

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИ ЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик,р 1830229(22) Заявлено 110779 (31) 2794553/18-25с присоединением заявки Йо(51)М. Кл. О 01 й 27/46 Государственный комитет СССР но дедам изобретений н открытиИ ФщэщЯ. А. Александровский, А. А. Сухно, Ю."В, РойИОняви Л, А. ПирузянэАОрдена Ленина институт химической фйзикй%Н-СС:Я(54) ФЕРМЕНТНЫЙ ЭЛЕКТРОД ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫИзобретение относится в аналитической биохимии и может быть использовано в научно-исследовательской работе, пищевой и микробиологической промышленности, бродильном произведстве, клинических исследованиях,Известен фенментный электрод для определения глюкозы, содержащий электро и полупроницаемую мембрану, между которыми содержится нативная или иммобилизованная глюкозооксидаза. В качестве акцепторов электронов используют хинон или ферроцианид, добавляемые в измерительную ячейку. Концентрацию глюкозы определяют по скорости ферментативной реакции, регистрируя величину тока окисления восстановленного акцептора, образующегося в результате ферментативного процесса Г 13Однако используемые акцепторынизкомолекулярны и не могут находиться в реакционной зоне за полупроницаемой мембраной и, следовательно,находятся,в исследуемой системе. Нетдостаток существенно сужает областьприменения данного устройства, которое преимущественно используют дляанализа дискретных проб,Наиболее близким по техническойсущности .и достигаемому эффекту к предлагаемому является ферментный электрод, содержащий индикаторный электрод, глюкозооксидазу и полупроницаемую мембрану. Измерение скорости ферментного процесса регистрируют по величине тока восстановления кислорода на кислородном электроде, .Такое устройство обладает тем преимуществом, что протекание реакции и нужный аналитический сигнал обеспечиваются легко диффундирующим че-.рез мембрану кислородом, растворенным в исследуемом образце, находящимся в контакте с воздухом, и не требует использования искусственных акцепторов электронов 2 .Недостатком такого устройства яв О ляется невозможность проведения анализа в бескислородном растворе и плохая воспроизводимость аналитического сигнала при проведении реакции в токе раствора с изменяющимся содержанием растворенного кислорода, например, цельной крови. Действительно, согласно законам ферментативной кинетики скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна концентрации глюкозы и кислорода, если послед..ние находятся в концентрациях нижесоответствующих значений величинкснстанты Михалиса (К ), Раствори"мость кислорода при нормальныхусловиях 240 мкМ несколько ниже Кглюкозооксидазы, для кислорода5820 мкМ, Следовательно, при Фиксированной концентрации глюкозы и пере,менной концентрации кислорода ферментный электрод обеспечивает ложныйаналитический сигнал,1 ОЦель изобретения - возможностьпроведения анализа глюкозы безре"агентным способом в бескислородныхжидкостях и повышение надежности измерений при анализе глюкозы в токераствора с изменяющимся содержаниемрастворенного кислорода,Поставленная цель достигается тем,что пространство в ферментном электроце между электрохимическим датчиком и полупроницаемой мембраной содержит раствор глюкозооксидазы иокислительно-восстановительный полимер, содержащий в основной или боковой цепи субстраты-акцепторы глюкозооксидазы в насыщающих для глюкозооксидазы концентрациях, например,хинон или виологен.Отличительной чертой устройстваявляется то, что оно содержит в качестве акцепторов электронов окислительно-восстановительный пОлимерныйсубстрат,Устройство работает следующимобразом.Глюкоза образца диффундирует через мембрану в реакционную зону Ферментного электрода, где протекает реакция,Механизм реакции окисления О-глюкозы под действием глюкозооксидазыследующий 40О-глюкоза+Е - э глюконо- Ю-лактон+Е НЕНа Аох ф Е+А вос,где Е и ЕН - окисленная и восстаЯ.новленная Формы фермента; 45А и А - окисленная и восстановак ьосленная форма акцепторов электронов,Окисление восстановленной формыглюкозооксидазы происходит под дей- . 50ствием полимерного акцептора, легкоудерживаемого как и фермент в реакционной зоне полупроницаемой мембраной,О концентрации глюкозы судят либопо начальной скорости ферментной реакции " по скорости увеличения токаокисления накапливающейся восстановленной Формы полимерного акцепторана графитовсм электроде, либо по стационарным значениям тока окисления, 60П р и м е р 1, В пространствомежду графитовым электродом и полупроницаемой мембраной помещено 10 мкл .раствора полибензилвиологена в концентрации 5 10М и 10 мкл раство ра глюкозооксидазы в концентрации 10 М, Ферментный электрод помещают в 1 мл ячейку, содержащую бескислородный фосфатный буферный раствор рН 7,6 и, добавляя стандартные количества 56 мкл калбированных раствором глюкозы, измеряют стационарные значения тока окисления полибензилвиологена при потенциале 0,2 В(НКЭ), Концентрация глюкозы в калиброванных растворах от 25 - 400 мг%. На основании полученных данных строят калибровочный график зависимости стационарных значений тока окисления полимера от концентрации глюкозы.П р и м е р 2. Аналогично примеру 1, но вместо полибензилвиологена, используют раствор полихинона в концентрации 510М. На графитовой электрод подают потенциал 0,4 В (НКЭ)Использование предлагаемого устройства ферментного электрода для определения глюкозы обеспечивает по сравнению с известным следующие технико-экономические преимущества: позволяет проводить анализ глюкозы безреагентным способом в бескислородной, среде; повышает надежность получения достоверных данных о концентрации глюкозы в токе растворов с изменяющимся содержанием кислорода, например, в токе цельной крови и может быть использовано при проведении процессов ферментации в микробиологической промышленности, в бро. дильном производстве, в фармацевтической промышелнности, в научных исследованиях, преимущественно для анализа глюкозы в протоке сложных по составу жидкостях, например, в токе цельной крови, что важно при проведении большого числа хирургических операций. Решение задачи по созданию искусственной поджелудочной железы и автоматического регист- . рирующего дозатора инсулина, имплантируемого больным диабетом.Формула изобретенияФерментный электрод для определения глюкозы, содержащий индикаторный электрод, полупроницаемую мембрану и раствор глюкозооксидазы, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью расширения функциональных возможностей устройства и повышения точности измерений в растворах с изменяющимся содержанием кислорода, пространство между индикаторным электродом и полупроницаемой мембраной заполнено раствором глюкозооксиазы и окислительновосстановительным полимером, содержащим в основной или боковой цепи субстраты-акцепторы глюкозооксилазыш шааевющ,щ ью Ш Заказ 3291/51 Тираж 907Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, москва, Ж, Рауыская наб., д. 4/5филиал ППП "Патентф, г; ужгород, ул, Проектная, 4 в насьпцающих для глюкозооксидазыконцентрацияхИсточники информации,принятые во внимание при экспертизе