Способ получения хиноидного пигментарегулятора метаболизма

сл йлг 1 Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 22. 11. 78 (21) 2687982/28-13 (51) М. КЛ. С 12 О 13/10 с присоединением заявки Нов(23) Приоритет -Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХИНОИДНОГО ПИГМЕНТА-РЕГУЛЯТОРА МЕТАБОЛИЗМА 2ная кислота в соотношении 6-4:1, хлороформ - этанол в соотношении 95:5, бензин - эфир в соотношении 5:2.Полученное соединение обладает токсичным действием на куриные эмбрионы в дозе 50 мг на яйцо.Недостатками способа являются: длительность способа (1-2 мес); необходимость культивирования продуцента на пищевом сырье (зерно, рис, дрожжевой экстракт), что значительно удорожает производство; получение пигмента из мицелия гриба, что требует высушивания, размалывания и 16-часовой экстракции целевого продукта 1.громоздкость и трудоемкость способа.Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ получения иэ плесневого гриба Аврег цв иелс 11 эмодиноокрашенного грибного метаболита антрахиноновой природы 2).Способ состоит в том, что гриб АврегдП 1 цв. иепс 11 выращивают поверхностньм методом на раздробленной пшенице с добавлением дрожжевого экстракта в течение 3 нед при 28 С. Через 3 нед мицелий гриба три раза экстрагируют хлороформом, экстракты Изобретение относится к способам получения микробных метаболитов и производству протеаз тромболитического действия и может быть применено в микробиологической промышленности, медицине, фармакологии и физиологии.Известен способ получения из Аврег 9111 цв иепс 11 окрашенных метабо. литов, имеющих максимумы поглощения при 270, 295 и 452 нм (11 .Способ состоит в выращивании Аврегц 111 цв иепс 11 поверхностным методом в течение 2 мес на зерне или рисе или в течение 1 мес - на среде, содержащей дрожжевой экстракт и са харозу. После этого мицелий отделяют от культуральной жидкости, высушивают, размалывают и экстрагируют хлоро формом в аппарате Сокслета. Через 16 ч экстракции полученный раствор 20 концентрируют при нагревании в испарителе. Хлороформенные экстракты мицелия очищают тонкослойной хромато. графией на АОвог Ьов 1 е. Полученные пятна экстрагируют смесью хлороформа 5 и ацетона, растворы концентрируют и подвергают рехроматографии в следующих системах растворителей по порядку: хлороформ - ацетон в соотношении.50 г 50, толуол - этилацетат - муравьи-.30 Московский ордена Ленина и ордена Трудового КрасногоЗнамени государственный университет им. М.Б.Ломоносоваводную Фазу высушивают на воздухе до влажного осадка, а затем экстрагируют азеотропной смесью хлороФорм: этанол:вода в соотношении 91:5:4 или толуол:этанол:вода в соотношении 51:37:12 обезвоживают и отгоняют в вакууме досуха, Очистку раствора пиг.мента проводят на активированном силикагеле. Элюирование пигмента осуществляют смесью бензол-эфир.Полученный пигмент имеет максимумы поглощения при 267 и 453 нм и дает характерное окрашивание с уксуснокислым магнием, что позволяет отнести полученное соединение к группе оксиантрахинонов.Пигмент по своей природе бли зок к эмодину и ализарину.В таблице приведены результатыбиологического действия полученного пигмента на микроорганизмы. рино-ф ичеся ак- ность.ед./ д 1апапь 1 ь б Аьре1 ц 5дача я придасвойств аз микроие спосо 5 5 Аьрегд1- 1 ць Кападаыаепь 1 ь с внесением через 24 ч хиноидного пигмента из ку- льтуральной жидкостиАьрегд(1- 1 ць хепс 11 Поставленная цель достигается тем, что культивирование продуцента ведут на синтетической среде, содержащей сахарозу, глюкозу, КЧОЗ,Ид 504 и К НРО 4 глубинным методом в течение 48-72 ч, а экстракции подвергают культуральную жидкость, предварительно обработанную ацетоном, причем в каче стве экстрагента используют азеотропную смесь хлороФорм:этанол:вода в соотношении 91:5:4 или толуол:этанол:, вода в соотношении 51:37;12 и элюи р рование экстракта при хроматограФий осуществляют смесью бензол:эфир в соотношении 1;1.Сущность способа состоит в том, что для получения хиноидного пигмента оксиантрахиноновой природы используют культуральную жидкость гриба Аьрегд 111 ць иеп 11, штамм 31 Ъ, Гриб выращивают на известной и простой по составу синтетической среде, содержащей сахарозу, глюкозу, азотнокислый калий, сернокислый магний и двузамещенный фосфорнокислый калий. Культивирование продуцента ведут глубинным способом в течение 2-3 сут, что существенно сокращает время,затрачиваемое на получение целевого 60 продукта. Выделение пигмента осуществляют не из мицелия, а из культуральной жидкости, которую обрабатывают ацетоном в соотношении культуральная жидкостыацетон 1:4 - 1:5. Полученную Я 80,5 10 04из Фильтруют в вакууме через безводныйсульфат натрия, Фильтрат концентрируют и подвергают хроматографии насиликагелевой колонке в градиентеэлюции от толуола к этилацетату,Дальнейшую очистку проводят в системе толуол - этилацетат - муравьинаякислота в соотношении 5:4:1, а затемв.системе хлороформ - ацетон в соот-ношении 93:7. Эмодин кристаллизуютиз этанолового раствора. Полученныйпрепарат обладает величиной 070,равной 3,7 мг/кг, при концентрацияхв 12,2 и 37 мг/кг вызывает гибель однодневных петушков в 83 случаев, вменьших же дозах возможно медицинскоеприменение эмодина в качестве слабительного средства,К недостаткам прототипа относится:длительность культивирования грибапродуцента (21 сут); использование вкачестве сред для выращивания продуцента пищевых продуктов, что удорожает способ; пигмент-регулятор выделяют из мицелия гриба, что требует определенных операций по его разрушениюсложность и громоздкость способа, состоящего из многих операций; отсутствие стимулирующего биологическогодействия на микроорганизмы,Целью изобретения являетсние регулятору стимуляторныхв отношении биосинтеза протеорганизмами, а также ускорен Как видно из таблицы, полученный по предлагаемому способу хиноидный пигмент является биорегулятором жизненного цикла и процесса биосинтеза протеаз тромболитического действия Аарегд 111 ца Кападаиаепь 1 в, Введение этого соединения в развивающуюся культуру гриба-продуцента протеаз (Аар.Кападаыаепя 1 ь) в момент начала синтеза протеаз (24 ч роста) ведет к значительному в 2,0-2,5 раз увеличению выхода протеолитических ферментов, обладающих способностью к растворению тромбов крови человека.П р и м е р 1. В синтетическую среду, содержащую, нес,3: сахарозу 0,72; глюкозу 0,3 б; КМО 0,21 Мд 5 0,123 и КНР 04 1,37, после стерил 11155 Формула изобретения 20 50 Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Заказ 6622/36 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 ции вносят 5 об.% двухсуточного жидкого посевного материала Азрегд 11 цз иепс 11, выращенного на посевной среде, состоящей из 4-х баллиногового сусла, Культивирование гриба осуществляют глубинным способом в колбах на 750 мл со 100 мл среды на качалках (200 об/мин) при 28 С в течение 72 ч. По истечении этого времени куль туральную жидкость отделяют от мицелия, концентрируют на роторном испарителе при 40 С, обрабатывают ацетоном н соотношении культуральная жидкость:ацетон 1:5 на магнитной мешалке при 40 С. При этом наблюдаетсяоразделение на два слоя:светло-желтый ацетоновый и темно-оранжевый водный,в котором концентрируется пигмент.Обработку производят несколько раздо полного обесцвечивания ацетонового слоя. Водный концентрат пигментавысушивают на воздухе до влажногоостатка, а затем экстрагируют азеотропной смесью хлороформ;этанол:вода в соотношении 91:5;4, обезвоживают пропусканием через Ма 2504, отгоняют в вакууме досуха и растворяют в бенэоле при температуре кипения. Очистку осуществляют с помощью хроматографии на активированном при 200 С силикагеле с элюированием смесью бензолэфир в соотношении 1:1, отгоняют ввакууме досуха, растворяют в хлороформе и получают пигмент, имеющий максимумы поглощения при 267 и 453 нми обладающий биологическим эффектомстимуляции в 2,5 раза биосинтезапротеаз тромболитического действияплесневым грибом Азре гд 111 цз Кападаиаепз 1 з (см.таблицу).П р и м е р 2. В синтетическуюсреду указанного выше состава после.стерилизации вносят 5 об. двухсутси ного жидкого посевного материалаАврегд 111 цэ иепс 1, выращенного напосевной среде, состоящей из 4-х баллиногового сусла. Культивированиегриба осуществляют глубинным способом в колбах со 100 мл среды на качалках (2 ЛЛ об/мин) при 28 С в течение 48 ч, По истечении этого временикультуральную жидкость отделяют отмицелия, концентрируют на роторномиспарителе при 40 С и обрабатываютацетоном по укаэанной выше методикепри соотношении культуральная жидкость;ацетон равном 1;4. Полученныйводный экстракт высушивают на воздухе до влажного остатка, а затем экстрагируют азеотропной смесью толуол:этанол:вода в соотношении 51;37:12,обезвоживают пропусканием черезМа 04, отгоняют в вакууме досуха и растворяют в бензоле при температуре кипения. Очистку производят по указанной выше методике. Полученный пигмент имеет максимумы поглощения при 267 и 453 нм и обладает биологическим эффектом стимуляции в 2 раза биосинтеза протеаз тромболитического действия плесненым грибом Аьрегд 111 цз Кападаиаепз 1 з.Предлагаемый способ по сравнению с известными решениями подобного рода имеет следующие преимущества: получение целевого продукта из культу- ральной жидкости; получение целевого продукта, обладающего стимулирующим действием на биосинтез протеаз тромболитического действия; ускорение способа; упрощение способа; повышение экономичности способа. 1, Способ получения хиноидногопигмента-регулятора метаболизма изплесневого гриба Азрегд 111 цз иепй 11,предусматривающий его культивирование с последующим выделением целевого продукта путем экстракции органическими растворителями и хроматографии на силикагеле, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью придания регулятору стимуляторных свойствв отношении биосинтеза протеаз микроорганизмами, а также ускорения способа, культивирование продуцента ведутна синтетической среде, содержащейсахарозу, глюкозу,. КМОЗ,Мд 504 иК НР 04 глубинным методом н течение4 оч, а экстракции подвергаюткультуральную жидкость, преднарительно обработанную ацетоном, причем. вкачестве экстрагента используют азеотропную смесь хлороформ:этанол;водав соотношении 91:5:4 или толуол:этанол:вода в соотношении 51:37;12 иэлюирование экстракта при хроматографии осуществляют смесью бензол:эфирв соотношении 1:1,2. Способ по н.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что культуральнуюжидкость обрабатывают ацетоном,взятым в соотношении 1:4-1:5. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1.иц М,Т.,Аугеь ,1.С., КосЬ 1 ег Р,Е,апд СЬазз С. Мохс нейаЬо 1 Се ргос 1 цсед Ьу Аврегд 11 цз иепй 11.-"Арр 1 едв 1 сгоЬо 1 оду", ч,27, Р 2, р.337, 1974.2, Ие 11 з 1.М.,Со 1 е Р 1.К 1 гзеу Э.Ч.Ещос 11 п,1 Сохс щесаЬоЬсе оГ Аярегд 11 цз иепС 11 1 ьо 1 асед загса Яееч 11 Оавадес СЬеьсщсь.-"Арр 1 ес в 1 сгоЬооду", Р 1, р,26, 1975 (прототип).