Способ культивирования вирусов

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик(51)М. Кл. С 12 Н 7/00 с присоединением заявки Нов Государствеииый комитет СССР ио делам изобретеиий и открытий(53) УДК 5 76. 8. 0 9 3. ,1(088. 8 ) Дата опубликования описания 2 30 7.81(71) Заявитель Институт полиомиелита и вирусный энцефалитовАМН СССР(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ Изобретение относится к микробиологической промышленности а именнокультивированию вирусов.Известен способ культивированиявирусов путем размноженйя их на линиидиплоидных клеток 11) .Однако известный способ являетсямалодоступным, кроме того линии клеток высоко чувствительны к определенным питательным средам и сывороткам.цель изобретения - упрощение способа,Это достигается тем, что вирусыразмножают на линии диплодных клетоккожи и ьвшц эмбриона зеленой мартышки 5018полученная линия диплодных клетоккожи и мышц эмбриона зеленой мартышки 5018 имеет следующие биОлогические,генетические и морфологические характеристики,Культура состоит из фибробластоподобных клеток. Морфология клеток остается стабильной в течение фазы активного роста.Клетки легко снимаются со стеклараствором трипсина, хорошо растут насреде МЭМ с 10 сыворотки крупногорогатого скота. Коэффициент развивкидостигает величины 1 : 2, 1 : 3,1: 4, При субкультивировании клеткй быстро прикрепляются к стеклу и на 3-4 сутки образуют монослой.Клетки имеют ограниченное время жизни вне организма, до 57 пассажа, на протяжении Фазы активного роста не теряют своих генетических свойств, При кариологическом анализе установлено, что на уровнях 10,20,30 и 40 пассажей модальный класс составляли клеткй с диплоидным набором хромосом (2 п - 60) . Число диплоидных клеток на протяжении Фазы активного роста колебалось от 80, 3 до 85,5, гипоплоидных . 3,0 - 4,3, гиперплоидных,3 - 2,0. Хромосомы обследованных диплоидных клеток не отличались от хромосом, характерных для самца африканской зеленой мартышки, Корреляции между уровнями различных отклонений не отмечено, При сравнении хромосомных наборов на разных уровнях пассажей различий не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии контаминации линии другими клетками. Различий также не выявлено в рисунке дифФеренцированности хромосом по длине при окраске по Гимза, что свидетельствует о генетической стабильности культуры.. Иэоферментная характеристика клеток линии в отношении лактадегидрогенаэы и глюкозо-фосфатдегидрогеназыподтвердила идентичность их клеткамобезьяны.Клетки линии 5018 не контамированыбактериями, грибами и микроплазмами.Посторонние вирусы не выявлены ни вкультуральной жидкости, ни в клетках,Тесты на онкогенность также были отрицательными,По мере размножения клетки замораживают на различных уровнях пассажейдля хранения в жидком азоте, такимобразом создают их банк. При восстановлении сохраняют жизнеспособностьна 80-85,Клетки линии чувствительны к различным вирусам: группы ЕСНО,полиомиелита, кори,.пенящему и цитомегаловирусу обезьян.Характер цитопатических измененийпод действием вируса полиомиелиташтаммов Сэбина по морфологии и срокам развития не отличается от наблюдаемого в первичной культуре клетокпочек зеленых мартышек, используемыхдля изготовления вакцины против полиомиелита.Некоторые вирусы из группы ЕСНОтипы 3-6,11,13,15,19,20, симпластообразующий вирус обезьян на клетках линии 5018 размножаются более активно,чем на первичных культурах клетокпочек обезьян, и также с характернымцитопатическим эффектом.,Приводятся примеры культивированиявирусов на линии диплоидных клетоккожи и мышц зеленой мартышки 5018.П р и м е р 1, Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сэбина 1 типа.В матрасную колбу с диплоиднымиклетками кожи и мышц эмбриона зеленой мартышки 5018 на уровне 7 пассажа вводят 0,25-ный раствор трипсина,подогретый до 37 С, Через 10 с трипсин удаляют, а сосуд с клетками помещают в термостат при температуре 37 Сна 2 мин. Затем отслоившиеся клеткиресуспендируютв среде роста - средуМЕМ.с 10 сыворотки крупного рогатого скота, и разливают на две матрасные колбы. Эти культуры 8 пассажа инкубируют при 37 еС, в течение 4 сутокдо момента формирования сплошногослоя.При заражении вирусом среду изкультуральных сосудов сливают, клеткитрижды промывают раствором Эрла ивводят вируссодержащую жидкость израсчета 2 БОЕ на клетку. Затем добавляют поддерживающую среду, в качестве которой используют среду МЕМ.Инфицированные культуры инкубируют при34 С, Сбор вируса производят на 4день после заражения и определяют еготитр по методу образования бляшек.Титр равен 7,4 БОЕ/мл. При культивировании вируса в первичной культуре клеток почек обезьян его титр равен .7,5 0 ц БОЕ/мл.П р и м е р 2, Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сэбина П типа.Клетки линии 5018 на уровне 8 пассажа получают и заражают вирусом поспособу, описанному в примере 1, Титр вируса равен 7,3 0 д БОЕ/мл. При культивировании вируса в первичной культуре клеток почек обезьян его титр равен 7,4 ц БОЕ/мл,П р и м е р 3, Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сэбина111 типа,Клетки линии 5018 на уровне 8 пассажа получают и заражают вирусом поспособу, описанному в примере 1.Титрвируса равен 7,2 2 д БОЕ/мл. При культивировании вируса в первичной культуре клеток почек обезьян его титрравен 7,5 8 д БОЕ/мл.П р и м е р 4. Способ культивированйя вирусов из группы ЕСНО,Клетки ливии 5018 получают по методу, описанному в примере 1,При заражении вирусами среду из культуральных сосудов сливают, клетки промывают раствором Эрла и вводят 1 мл нераэведенной культуральной жидкости, собранной после заражения определенным типом вируса первичной культуры кле. ток почек обезьян. Для адсорбции вируса культуры выдерживают при 37 О С в течение 1 ч при постоянном покачивании, после этого добавляют поддерживающую среду. Культуры инкубируют при37 ОС до развития цитопатического эффекта, Сбор вируса проводят через 5-7 дней после заражения и определяют его титр.Параллельно аналогичным способом заражают первичную культуру клеток почек обезьян. Во всех случаях в клетках линии 5018 вирусы нз группы ЕСЙО размножаются более активно: для вирусов ЕСНО 3-5, 11,13 титр составляет 10по сравнению с 10 ,ЕСНО 6, 19 - 10и 10-6,о, ЕСНО 2010 6 о и 10и 10ТЦДао/млП р и м е р 5. Способ культивирования пенящего вируса обезьян.Клетки линии 5018 на уровне 15 пассажа отделяют от стекла по методу, описанному в примере 1, и эксплантируют в литровую роллерную бутыль в количестве 60 106 клеток. Культуру инкубируют при 37 ОС,во вращающемся состоянии со скоростью 18 об./ч в течение 24 ч до момента формирования монослоя, При заражении вирусом среду из культуральных сосудов сливают, клетки промывают физиологическим раствором и вводят вирус иэ расчета 10 ТЦД 5 о/мл.в объеме 30 мл поддерживающей средЫ. Вращательным движением вируссодержащую жидкость равномерно распределяют по монослою. Адсорбцию764390 Формула изобретения Составитель Г. СмирноваРедактор Т.Колодцева Техред Т. Маточка Корректор М.Пожо 3 аказ 5 769/40 Тираж 528 Под пи с ное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 1130 35, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Ф, Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, Ул. Проектная, 4 вируса проводят при 37 дС в течение1 ч при постоянном вращенииЗатемвируссодержащую жидкость удаляют, ав сосуд вносят 100 мл поддерживающейсреды с 1сыворотки телят. Культуры помещают в барабан и вращают с той 5же скоростью при 37 С в течение 4дней, После этого проводят сбор вируса с последующим титрованием по развитию цитолатического эффекта. Его титррав ен 10 ТЦД о/мл. 0Параллельно вирусом заражают первичную культуру клеток почек обезьянв матрасной колбе, находящейся в стационарном положении. Вирус в ней размножается до титра 10 ь ТЦДа/мл,П р и м е р 6. Способ культивирования цитомегаловируса обезьян.Клетки, линии 5018 на уровне 20пассажа культивируют по методу, описанному в примере 1,При заражении вирусом среду из 20культуральных сосудов сливают и вводят неразведенную вируссодержащуюжидкость, собранную со спонтанно зараженных цитомегаловирусом культурклеток почек эмбриона на зеленой мартышки, в количестве 1 мл, Адсорбциювируса проводят при 37 С в течение1 ч, После этого добавляют поддерживающую среду. Культуры инкубируют при37 с в течение 5 дней, После этогопроводят сбор вируса с последующимтитрованием по развитию цитопатического эффекта, титр которой равен 10ТЦД ,/мл,В первичных культурах клеток почек зеленых мартышек вирус размножается менее активно и достигает титра1 0 ТЦД 5 о/мпПредлагаемый способ позволяет увеличить количество субстратов, используемых для культивирования вирусов,в, частности; применение для к 1 льтиви-, рования вирусов нового субстрата, об-. ладающего стабильными биологическими, генетическими и морфологическими характеристиками в стадии активного роста, не обладающего онкогенностьв, легко культивируемого й являющегося чувствительным комногим вирусам.Линия диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона зеленой мартышки отличаетсялегкостью получения и субкультивирования. При использовании ростовой среды МЕМ с добавлением 10сыворотки крупного рогатого скота не требует особых видов питательных сред и дефицитной эмбриональной сыворотки .телят, обладает устойчивыми морфологическими, биологическими и генети" ческими особенностями. Она чувствительна ко многим вирусам, что открывает перспективы широкого использования в вакцинном производстве. Ее клетки хорошо сохраняются в жидком азоте.Использование линии в производстве вакцин позволит снизить импорт обезьян и готовить большие партии вакцин на стандартном клеточном субстрате. Способ культивирования вирусов путем. размножения их на линии диплоидныхклеток, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью упрощения способа, вирусы размножают на линии диплоидныхклеток кожи и мюц эмбриона зеленоймартышки 5018,Источники информации,принятые вовнимание при экспертизе1.Патент США 94040905,кл 195/18