Клеточная линия тимуса эмбриона крупного рогатого скота мва 76 “продуцент” онкорнавируса типа с(тэк-мва-76)

пвтен оий Союз Советееа Социалистицесва Рвспублик(72) Авторы изобретения Московский ордена Трудового Красного Знамениветеринарная академия имени К, И. Скрябина 1) Заявите(54) КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ ТИМУСА ЭМБРИОНАКРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МВА- ПРОДУЦЕ ОНКОРНАВИРУСА ТИПА С(ТЭК-МВА) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, конкретно к культивированию тканей для получения вирусных препаратов, и представляет собой новую перевиваемую линию клеток продуценть онкорнавируса типа С, используемого для размножения онкорнавируса, а также для приготовления онкорнавирусных антигенов для серологических реакций и для специфической профилактики онкорнавирусной инфекции.Известны краткосрочные культуры лейкоцитов лейкозного скота, которые продуцируют частицы онкорнавируса, что имеет неоспоримую ценность в изучении онкорнавируса типа С крупного рогатого скота 1 и 2,Однако низкий уровень продукции вируса и дегенерация клеток, сопровождающая высвобождение вирусных частиц, сильно затрудняют процесс концентрации и очистки вируса, Кроме того, эти культуры позволяют получать только внутренний вирусный антиген с молекулярным весом 24000 дальтон, который в серологических реакциях выявляет не всех животных носителеи онкорнавирусной инфекции,Описанная Феррером линия клеток ВС,полученная из лимфоцитов лейкозного животного и выращиваемая в виде суспензионной или монослойной культуры, продуцируетчастицы онкорнавируса крупного рогатогоскота типа С, выявляемые с помощью электронной микроскопии и иммунофлуоресцентным методом 3.Однако низкая продукция вируса этими10 клетками не позволяет получать его в препаративных количествах для последующейконцентрации и очистки.В нашей стране выведена перевиваемаяклеточная линия селезенки плода лейкознойкоровы, которая может быть использована,в частности, для изучения онкорнавирусовкрупного рогатого скота 4.Однако эта линия клеток не являетсяпродуцентом онкорнавируса крупного рогатого скота или его антигенов.20 Наиболее близкой по своим полезнымсвойствам к предлагаемой линии являетсяоднослойная культура клеток селезенки плода овцы, инфицированная онкорнавирусом73- крупного рогатого скота, полученьая в СШАдоктором Ван дер Маатеном 15.-Эти длительно пассируемые фибробластоподобные клетки продуцируют онкорндвирус.и онкорнавирусные антигены и используютсядля накопления и концентрации вируса и антйгенов с целью изучения их свойств ииспользования в серологических реакциях,Однакоэти длительно пассируемые клетки не являются перевиваемой линией и, сле - довательно, не могут размножаться неопре - деленно долго; и в процессе старения обречены на вырождение, кроме того, они заражены штаммом онкорнавируса, выделенным в СШАот "местного крупного рогатого скота, больного лейкозом, что ограничивает возможности исследования этих клеток для изучения вирусологических аспектов лейкоза в нашей стране, Клетки селезенки плода овцы выращиваются на питательной среде, содержащей 20% сыворотки плода коровы, которая не выпускается в промышленных масштабах в нашей стране.Целью изобретения является линия перевиваемых клеток, хронически инфицированная отечественным штаммом онкорнавируса крупного рогатого скота, интенсивно продуцирующая онкорнавирус и онкорнавирусный антиген и обладающая способностью хорошо репродуцироваться на отечественной питательной среде с коммерческой сывороткой крупного рогатого скота, служащая надежным источником онкорнавируса и онкорнавирусного антигена для изучения вирусологических аспектов лейкозов крупного рогатого скота.На рис. 1 представлена электронная микрофотография клеток линии МВА; на рис. 2 - микрофотография вирусных частиц типа С.Клеточная линия тимуса эмбриона коровы МВА, инфицированная отечественным штаммом онкорнавируса крупного рогатого скота, продуцирующая как онкорнавирус, так и растворимые онкорнавирусные анти- гены, имеет следующие морфологические и физиолбгические характеристики. Клетки МВАрастут на поверхности стекла в виде однослойной культуры. По морфологии клетки культуры МВАоднородны и имеют фибробластоподобную форму с круглым или овальным ядром, содержащим 1 - 4 ядрышка округлой формы.Пример. Клетки культивируются 1 п чего при 37 С в питательной среде, состоящей из среды Игла и 10% сыворотки крупного "рогатого скота.Оптимальная плотность посадки составляет 15 Х 104 клеток в 1 мл среды. Моно- слой формируетсяна 4 - 5 суток. В процессе созревания культуры происходит постепенное закйсление среды, С поверхности стекла клетки хорошо снимаются подогретым до 37 С 0,02%-ным раствором Версена. Клетки 02073обладают хорошей адгезивной способностью, пересеиваются 1 раз в неделю, Коэффициент пересева равен 1: 3 - 1: 4. Линия клеток не контаминирована микоплазмами и цито- патогенными вирусами.Линия перевиваемых клеток тимуса эмбриона коровы МВА, хронически инфицированная онкорйавирусом крупного рогатого скота, получена путем сокультирования клеток тимуса эмбриона коровы на 4 пассаже с лейкоцитами крови лейкозной коровы, ин фицированной онкорнавирусом крупногорогатого скота. В процессе пассажей (на уровне 30 пассажа) морфология клеток стабилизировалась. Клетки имеют фибропластоподобную форму (рис. 1) и продуцируют в питательную среду онкорнавирус крупного рогатого скота и вирус - индуцированный антиген, Продуцируемый клетками онкорнавирус идентичен исходному вирусу, использованному для заражения клеток, имеет под электронным микроскопом типичную для 20 вирусных частиц типа С морфологиюцентрально расположенный электронноплотный нуклеотид отдельный от двухслойной оболочки просветом. Размер нуклеотида ,составляет 60 - 80 нм, а всей вирусной частицы 120 нм (рис, 2), Продукция онкорнавирусного антигена этой культурой выявляется с помощью реакции иммунодиффузиив агаровом геле с использованием тест-системы для идентификации онкорнавирусных антигенов (сыворотка крупного рогатого ЭЮ скота, содержащая антитела к гликопротеидному антигену вирусной оболочки и онкорнавирусный гликопротеидный антиген) .Технико-экономическая или иная эффективность. Клеточная линия тимуса эмбриона коровы МВА- продуцент онкорнавируса крупного рогатого скота интенсивно продуцирует онкорнавирус и онкорнавирусные антигены. Продукция вируса в этой клеточной системе значительно более высокая, чем в краткосрочных культурах лейкоцитов лейкозных животных. Нативная культуральная жидкость шестисуточной культуры клеток МВАможет быть использована в реакции связывания комплемента в качестве анти- гена для выявления онкорнавирусных антител у инфицированных животных. В отличие от краткосрочных культур перевиваемые клетки МВА, продуцируя вирус, не разрушаются и не загрязняют клеточнымиобломками вирусный материал, что существенно облегчает процесс концентрации и очистки вируса и вирусных антигенов.Преимуществом перевиваемой линииклеток МВАявляется то, что она хронически инфицирована отечественным штамф мом онкорнавируса и культивируется на отечественной питательной среде с сывороткой крупного рогатого скота. Концентрация жидкой фазы культуры клеток линии МВАпозволяет получать онкорнавирусные анти- гены, используемые в реакции иммунодиффузии в агаровом геле для выявления животных носителей онкорнавирусной инфекции и для эпизоотологической оценки хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота.5Перевиваемая линия клеток МВАможет быть использована,для биофабричного производства онкорнавирусных антигенов,Формула изобретенияКлеточная линия тимуса крупного рогатого скота МВА-продуцент онкорнавируса типа С (ТЭК-МВА)-хранится в коллекции Московской ордена Трудового Красного 1 Знамени ветеринарной академии имени К. И, Скрябина.Морфологические признаки. Фибропластоподобные, отросчатые вытянутой формы клетки. Ядро овальной или округлой формы расположено эксцентрично. В популяции преобладают клетки с гетероплоидным набором хромосом.Физиологические признаки. Клетки культуры растут в виде монослоя в среде Игла с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, не содержащей антител к онкорнавирусу крупного рогатого скота. Оптимальная плотность посева составляет 15 Х 104 клеток/мл. Монослой формируется на 4 - 5 сутки. С поверхности стекла снимаются 0,02% раствором Версена, Индекс ЭО посева составляет 1: 3.Дополнительные признаки. Линия хро. нически инфицирована онкорнавирусом типа С, в цитоплазме клеток и в межклеточном пространстве образуются вирусные частицы типа С с,центрально расположенными электронноплотным нуклеотидом, отделенным от двухслойной оболочки просветом. Размер нуклеоида составляет 60 - 80 нм, а всей вирусной частицы 120 нм. Клетки продуцируют в питательную среду полный вирус, а также вирусиндуцированные антигены, выявляемые в реакции связывания комплемента и реакции иммунодиффузии в агаровом геле, Интенсивная продукция вируса и вирусных антигенов позволяет использовать нативную культуральную жидкость в качестве антигена для РСК и реакции иммунодиффузии в агаровом геле с целью выявления животных вирусоносителей и эпизоотологической оценки хозяйств по лейкозу.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. Шишков В, П., Кукайн Р. А.-Н Нагаева Л. И., Крикун В, А Кумков В. Т., Иткин Б. 3., Брацлавская О. И. и Лебедева Т. В. Выделение онкорнавируса типа С (штамм ЛЛ МВА) от крупного рогатого скота с персистентным лимфоцитозом, Доклады ВАСХНИЛ 1977, 5, 20.2. 1. М. М 11 ег, С. 01 зоп, 1, Яа 1. Сапсег 1 пз 1. 1972, 49, 1459 - 1462.3. 1. Е Геггег, М. Э, Мои. Р. 1.1 п, 1. Ха 1. Сапсег 1 пз 1. 1971;- 47, 613 - 621.4. Авторское свидетельство СССР578338, кл, С 12 К 9/00, 1977.5. М. 1. Чап бег Маа 1 еп, 1. М. М 111 ег, А, Э. Воойе, 1. Ха 1, Сапсег 1 пз 1. 1974, 52,491 - 497 (прототип).. Беловая ова ректор Е. Папиписное комитета и откры ская наб СоставительРедактор Л. дурасова Техред О, ЛуЗаказ 7542/29 Тираж 526ЦН И И П И Государственногопо делам изобретений113035, Москва, Ж - 35, Раушфилиал ППП а Патентл, г, Ужгоро СССРийд. 4/5Проектная, 4