Способ модификации полисахаридов

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИ ЕТЕЛЬСТЗУ Рвтек ,:, т, .;.Р(11732278 Союз Советскмк Соцмалнстическмя Реслублнк(51)М. Кл. С 08 В 15/06 Государстееяяыя яомятст СССР яо делам язобрстояяя в отярытяя(У 2) Авторы изобретения Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной знзимологии(54) СПОСОБ МОДИФИКАЦИИ ПОЛИСАХАРИДОВ Изобретение относится к химии .природных соединений, точнее к способам получения носителей (сорбентов) для иммобилизации, а также дпя хроматографической очистки белков, в особенности ферментов.Известен способ модификации аминоцеллюлозы сероуглеродом и изобутилхлорфермиатом, .позволяющий получить сорбенты для ковалентного связывания Ферментов 11.Полученный сорбент может взаимодействовать с водой, в частности с атмосферной влажностью, что отрицательно влияет наего устойчивость. 15 Использование его как сорбента для связывания Ферментов возможно только в водных растворах, так как ферменты не только не растворяются в органических растворителях, но и инактиви руются ими,Поэтому сорбент в процессе его применения взаимодействует не только с Ферментом, но и с раст. ворителем - водой.Наиболее близким к предлагаемому 25 является способ модификации целлюлозы путем ее обработки гексаметилендииэоцианатом с целью получения производного целлюлозы, содержащего ,свободные иэоцианатные группы, при годного для использования в качестве"орбента иммунобелков 2,Однако применение таких соединений для иммобилизации белков (в томчисле Ферментов) осложнено тем, чтоиз-за реагирования иэоцианатов совсеми реакционноспособными группамибелков легко происходит потеря каталитической активности Ферментов,вследствие модификации активногоцентра или других участков, а такжетем, что значительное количествосодержащихся изоцианатных групп теряется в побочной реакции гидролиэа,поэтому сорбционная емкость носителей небольшая,Цель изобретения - разработкаспособа получения модифицированныхполисахаридов, пригодных для иммобилизации и хроматографическойочистки белков, в том числе Ферментов, обладающих химической стабильностью, повышенной сорбционной емкостью, и тем самым расширение арсенала носителей (сорбентов)Указанная цель достигается тем,что модификация псансахаридов осуществляется их обработкой динзоцианатами с последующей дополнительной обработкой бифункциональными илипример 6220 носилом С52 2270 П р и м е р 2. Получение носителясодержащего карбоксильные группыНоситель получают как в примере 1,только вместо раствора гексаметилендиамина применяют раствор 2,0 гсебациновой кислоты в 30 мл диоксана. По данным элементарного анализапродукт содержит 4,5 И, Для иммобилизации ферментов синтезированныйноситель активируют водорастворимымкарбодиимидом известным методом.,Получены иммобилизованные препараты с активностью глюкозооксидазы1120 Е/г, аспергиллопепсина - 6,2 Е/ 4 О П р и м е р 3, Получение носителей, содержащих гидрофобные радикалы, Получение носителя ведут какв примере 1, только вместо растворагексаметилендиамина используют октиловый спирт. После аналогичной обработки получают носитель, содержащий октиловый остаток, присоединенный к Фенильному кольцу черезамидную связь (по данным элементарного анализа продукт содержит4,0 Б), функциональные свойстваносителя обусловлены гидрофобнымвзаимодействием с молекулами белков. При адсорбционной иммобилизации глюкоэооксидаэы на этом носи теле получен препарат с активностью80 Е/г, в то время как при применении исходной немодифицированнойцеллюлозы активность равна нулю.Аналогичным образом модифицирована сефароэа СЬВ, только в этомслучае водная суспензия носителяпереводится в органический растворитель и обратно в водную средупромыванием смесями диоксан-водас постепенно увеличивающейся (обратно-уменьшающейся) концентрацией оэ ба О монофункциональными соединениями в стехиометрическом избытке.В качестве бифункциональиых сое-динений используют алифатические диамийы и дикарбоновые кислоты С - СВ а в качестве монофункциональных соединений используют алифатические, спирты С 1 - С 8В качестве нерастворимого полисахарида применяют целлюлозу, агароэу, декстран, хитин, крахмал и их производные в виде порошков или гранул. Реакция с диизоцианатом проводится в безводных органических растворителях, не содержащих подвижных атомов водорода, например,в диоксане,ацетоне, хлороформе и др. Реакцию катализируют третичные основания и ",кислоты, наиболее подходящим является триэтиламин. Предпочтительны умеренные температуры - 20-50 С.Промежуточное производное после" удаления непрореагировавшего диизоцианата промыванием органическим растворителем, подвергают взаимодействию с бифункциональным или моно- функциональным соединением, содержащим подвижные атомы водорода, структура которого: выбирается в зависимости от назначения носителя, Реакция проводится в присутствии органического растворителя и катализатора, как указано для первой стадии, или без растворителя, применяя избыток реагента.В зависимости от длины алифатической цепочки Х получают носители с различной отдаленностью Функциональных групп (-ИН 1, -СООН и др.) от полисахаридной матрицы.П р и м е р 1, Получение носителя, содержащего аминогруппы К суспензии 3,0 г порошковой целлюл ы в 30 мл безводного диоксана при вляют 1 мл 2,4-толуолдииэоцианата, 5 капель тризтиламина и смесь медленно пере" мешивают б .ч при температуре 40-50 С, Затем целлюлозу отфильтровывают, промывают на фильтре 5-6 порциями диоксана по 20 мл . Полученное промежуточное производное по данным элементарного анализа содержит 4,7 И, В ИК- спектре имеется полоса поглощения при 2270 см , соответствующая свободным изоцианатным группам. Производное суспендируют в растворе 0,2 г гексаметилендиамина в 30 мл диоксана, содержащего 5 капель триэтиламина. Смесь нагревают 4 ч при 60- 80 С, после чего носитель отфильтроОвывают, промывают несколькими порциями диоксана, смеси диоксан-вода 1.:1 и водой. По данным элементарного анализа продукт содержит 6,5 И, Концентрацию вводимых аминогрупп можно варьировать путем изменения исходного соотношения полисахариддиизоцианат, а также изменением интенсивности условий реакции. Полученный носитель, содержащий аминогруппы, активируют известнымглутаральдегидным методом и исполь,зуют для иммобилизации ферментов. Результаты определения активностииьмобилизованных препаратов приве-,дены в таблице. Для сравнениятам же приведены данные, полученныепри иммобилизации тех же ферментовйа широкоиспользуемом носителемакропористом аминосилохроме С проведенной в аналогичных условияхи с теь: же исходным соотношениемФермент:носитель.732278 Составитель Т,МартинскаяТехред М.кузьма Коррректор Г. Решетйик Редактор В.Романенко Заказ 1535/3 Тираж 549 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент 1, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 диоксана. Активность иммбилнэованной на модифицированной сафарозеглюкоэооксидаэы 128 Е/гП р и м е р 4. Получение носителя, содержащего карбоксильные группы,Носитель получают как в примере 1Ртолько вместо раствора гексаметилендиамина применяют раствор 1,5 гадилиновой кислоты в 30 мл диоксана,По данным элементарного анализапродукт содержит 4,3 И, Для иммобилизации ферментов носитель активир;ют водорастворимым карбодиимидомизвестным методом, Получена иммобилизованная глюкоэооксидаза с активностью 938 Е/г,Спределение сорбционной емкостиносителей производят следующимобразом,0,5 г носител инкубируют в растворе 150 мг бычьего сывороточногоальбук;.ина (БСА) в 5 мл воды в течеоние 3 ч, при температуре 4 С. Затемноситель отфильтровывают, промываютводой, общим объемом 10 мл и в фильтрате определяют количество несвязанного БСА,Носитель, содержащий аминогруппыпо примеру 1, адсорбирует 233 мг/гБСА, а носитель, содержащий карбоксильные группы по,примеру 2155 мг/г БСА,Предлагаемьй способ модификацииполисахаридов является экспериментально простым и дает воэможностьполучить производные с различнойструктурой и свойствами по однотипной 2-стадийной методике. Полученные производные пригодны как носители для иммобилизации ферментов й др.белков и обладают при этом большойемкостью.сорбции, Активность иммобилизованных на аминопроизводномцеллюлозы ферментов в 1,6-2,8 раза,а иммобилиэованиых на носителе,содержащем карбоксильные группыв 4-7 раэ выше, чем при использовании обычного носителя - аминосилохрома. Возможность получения иммобилиэованных препаратов с. высоким уровнем каталитической активности и сбольшим выходом имеет существенноеэкономическое значение при практическом применении, Полученные носители, в отличие от производных,содержащих свободные изоцианатныегруппы, являются устойчивыми в водной среде. Активация носителей осуществляется обычными методами, поэтомузначительно снижаются потенциальныевозможности инактивации ферментов,существенной для носителей, содержа"щих изоцианатные группы. К достоинствам способа относится вариабельность структуры носителя посколькувследствие высокой реакционноспособиости изоцианатных групп, на второйстадии могут быть использованысоединения различной структуры, Такдля иммобилизации таких сложных;соединений как ферменты и др. белкитребуются достаточно специфическиесорбенты, расширение их арсеналаявляется весьма,полезным. Сфераприменения модифицированных полисаха"ридов не ограничивается иммобилиза" .цией белков. В частности, особенноперспективным может оказаться их 20 применение для хроматографическойочистки различных биохимикатов.Внедрение способа целесообразноосуществить в системе промьвгленности химических реактивов, предназначенных для биохимии и молекулярнойбиологии. Формула изобретения1, Способ модификации цолисахаридов обработкой дииэоцианатами, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью получения сорбентов, обладающих химической стабильностью ивысокой сорбционной емкостью, дляиммобилизации или хроматографической 35 очистки белков, проводят дополнительную обработку полученного продуктабифункциональными или Монофункциональными соединениями в стехиометрическом избытке.4 О 2. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем,что в качестве бифункциональных соединений используюталифатические диамины и дикарбоновыекислоты С- С 8.3. Способ по п, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве моно"функциональных соединений используюталифатические спирты С- СВ.Источники Информации,принятые во внимание при экспертизе 50 1. Авторское свидетельство СССР