Способ получения препарата иммобилизованной протеазы bacillus subtilis

СО 1 ОЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХГОСУДАРСТВЕННОЕВЕДОМСТВО СССР (ГО ПАТЕНТНОЕ СПАТЕНТ СССР)АНИЕ ИЗО) ЗЫ ио Иб ЖЮ1) С 12 ИИ И А 61 К 7 488785/04 772 Ю Боя,%45 иальиое констр логически актив генетики СО АН исов ЛА; Загреб(23) 0252 (22) 05.0 (46) 15 Л (УМ) Спец бюро био тологии и (72) Авет(УЗ) НМКТИ БАВ НПО "Вектор"(54) СПООЖ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕЛАРАТА ИМ. МОБИПИЗОВАННОЙ ПРОТЕАЗЫ ВАОЫЯВЗЦВТШ 3Настоящее изобретение относится к биотехнологии и, в частности, к способам получения иммобилиэованных ферментных препаратов, а именно к способу получения препарата иммобилиэованной протеазы 5 ВасИ 1 оз зоЬИ 1 з,Препарат иммобилизованной протеазы ВасИ 1 цз зоЬЮНз может быть использован в медицийе для лечения гнойных абсцессов и ран в,.биохимии для гидролиэа белков в 10 лабораторных:целях, а также в промышленности Длт гидролиза белковых смесей.В литературе описан ряд способов получения иммобилизованных протеаз ВасИцз зоЬсИ 1 з.Известен способ получения препарата иммобилизованной субтилопептидаэы А Вас. зоЬИз на пара-аминобензилцеллюлозе, который включает две стадии: актива-. цию матрицы путем диазотирования и 20 иммобилизацию фермента на активированной матрице.Недостатком способа является низкая протеолитическая активность и репаратов - менее 10 от исходной. 25Известен также способ получения препарата иммобилиэованной протеазы Вас.зоЬ 1 Из на силохроме С-ЯО, включающий активирование матрицы с помощью глутарового альдегида с последующей 30 иммобилизацией фермента. Источником протеазы служит раствор протосубтилина Г 10 Х, представляющий собой сложную смесь белков, включающую фермент протеазу, полученную после осаждения балласт ных белков из культуральной жидкости Вас 1 Иоз зцЫ 11 з ацетоном, центрифугирования и сублимационной сушки супернатанта.Способ получения препаратов иммобилиэованной протеазы заключается в следую щем, Силохром Собрабатывают аминопропилэтоксисиланом, а затем глутаровым альдегидом. К влажному активированному носителю добавляют ЗОВ-ный раствор протосубтилина Г 10 Х в количестве 45 27-30 ед.ПС/МГ / носителя, (За единицу ПС принимается такое количество фермента. которое в течение 1 ч при 38 С каталиэирует гидролиэ казвина в такой степени, что способность его связывать НС падает на 50 величину, эквивалентную 1 мл 0,1 н раствора йаОН). Процесс иммобилизации осуществляют при перемешивании на ледяной бане при рН 7.4-7.5, После чего препарат отделяют на пористом фильтре от жидкости. 55 Иммобилиэованный препарат промывают до исчезновения следов белка в промывных водах, Процент сохранения активности препаратов составляет 12.9-14 ь. Недостатком этого способа является низкий процент сохранения активности и ограниченность применения. Так. например, получаемый препарат невозможно использовать в медицине.Целью описанного способа является устранение недостатков известного способа, а именно. увеличение процента сохранения активности протеазы при иммобилизации,Указанная цель достигается за счет того, что в качестве матрицы для иммобилизации провазы используют аминоэтилцеллюлозу (АЕ-целлюлозу), а активацию матрицы проводят в 0,1-1 М фосфатном буфере при рН 6-9 в течение не менее 2 ч.Согласно изобретению описывается способ получения препарата иммобилиэованной протеазы Вас. зцЬОИз с высоким процентом сохранения активности, заключающийся в активации АЕ-целлюлозы глутаровым альдегидом в 0,1 - 1 М фосфатном буфере при рН 6-9 в течение не менее 2 ч с последующей иммобилиэацией фермента на активированном носителе.Процесс проводят следующим образом.В качестве аминоэтилцеллюлозы (АЭ- целлюлоза) используют препарат отечественного производства (завод химреактивов в г. Олайне) и фирмы "Реанал" (Венгрия). Протеазу Вас, зцЬИ 1 з берут в виде водного раствора.В качестве источника протеаз используют протосубтилин ГЗХ, очищенный по методу, который заключается в осаждении балластных белков раствором СаС 2, удалении осажденных белков центрифугированием и осаждении протеаз из надосадочной жидкости этиловым спиртом. За единицу активности протеаз принимают такое количество фермента, которое переводит в кислоторастворимую фракцию 1 мг тирозина за 15 мин при 37 С.Описываемый способ состоит из следующих стадий:- активиравание ЯЭ-целлюлозы глутаровым альдегидом в 0,1-1 М калий-фосфатном буфере при рН 6-9 в течение не менее 2 ч при комнатной температуре, при уменьшении времени активации снижается протеолитическая активность конечного продукта.- иммобилизация протеазы на активированной АЭ-целлюлозе при 4-5 С и перемешивании в 0,1 - 1 М растворе калий-фосфатного буферэ рН 7,3-7,7.Вносят 40-50 ед. акт, Фермента на 1 кг сухого веса активироданной матрицы.При уменьшении концентрации фосфорнокислых сопей в буфр ии активациий 86377 30 Составитель Л.АветисовТех ред М.Морге нтал Корректор Л.Пилипенко Редактор А,Колоскова Заказ 3348 Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-,издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 и иммобилизации снижается активность конечного продукта.Полученные препараты иммобилизованной протеазы имеют активность 32-40ед,акт,/г сух. препарата и сохранение активности составляет 17-30 от исходнойактивности,При гидролизе альбумина в проточнойколонке с иммобилизованной протеазой сохраняется 100 активности в течение 4-хсут при 25 С, В течение 3-4 сут в гнойнойране также сохраняется 100 активности.Преимуществом описываемого способа, по сравнению с прототипом, являетсяиспользование активированной целлюлозной матрицы для иммобилизации протеазы.В связи с этим получен высокий процентсохранения активности препарата иммобилизованной протеазы и высокая стабильность препаратов при гидролизе белков.Приведенный ниже пример служит иллюстрацией описываемого способа.Пример, 100 г влажной АЭ-целлюлозы(сухой вес 50 г) суспендируют в 230 мл 1 Мкалий-фосфатного буфера, рН 7,5; добавля. ют к полученной суспензии 75 мл 257 ь-ноговодного раствора глутарового альдегида.Смесь перемешивают в течение двух ч,Формула изобретенияСПОСОБ . ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ПРОТЕАЗЫ ВАСШ/3 ЯОВТ Я, включающий активирование матрицы с помощью глутарового альдегида и последующую иммобилизациюпротеазы, отличающийся тем, что, с целью фильтруют. Осадок на фильтое промывают водой 1 М водным раствором ИаС и вновь водой.К активированной АЭ-целлюлозе при ливают 250 мл раствора, содержащего 1375мг белка с удельной активностью 2 ед.акт/мг в 0,1 М калий-фосфатном буфере.Смесь инкубируют при непрерывном перемешивании в течение 10-12 ч при 5 С. Пол ученный продукт отфильтровывают,промывают 1 М водным раствором МаС до отсутствия оптической плотности в смывах, измеренной при 280 нм, и затем промывают водой; В результате получают 100 г иммоби лизованной протеазы с удельной активностью 32-40 ед. акт/г сухого веса с сохранением активности 17-30 от активности протосубтилина, взятого для иммобилизации при использовании казеина в 20 качестве субстрата.(56) ОоЫз 1 еи Е Юасег пзоцЫе емуеез ВосЬетигу 9, 2322, 1970,Калашникова А.М. Термо- и рН-стабиль ность растворимой и иммобилизованной насилохроме Спротеазы Вас, зоЬ 1 з. Прикладная биохимия и микробиология (6) 842, 1975. увеличения процента сохранения активйо.сти протеазы, в качестве матрицы используют аминоэтилцеллюлозу, а ее активацию проводят в 0,1 - 1 М фосфатном буфере при рН 6 - 9 а течение не менее 2 ч,