Способ получения препарата иммобилизованного субтилизина

О П И С А Н И Е910662ИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Соек СоеетсинкСоцналнстнчвсннкРеснубее(5 )М. Кл. С 08 Г 289/00 С 073 7/02 Екударстаавй юетет ИВР а йеан мбрвтаай вткуыейОпубликовано 07.03.82. Бюллетень МГДата оиублнкования описания 09.03.82(72) Авторы изобретен мИ 44 И; ,;,н.иверситет:йтут Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской и ордена Трудового Красного Знамени государст . им, М, В. Ломоносова и 1-й Московский орден и ордена Трудового Красного Знамени медициним. И. М. Сеченова(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ИММОБИЛИЗОВАННОГОСУБГИЛИЗИНА ние сттносит в, виме рата. иммоб иммобилизо уют в медИэобрет мии полимеро чения ирена тилизина. Препара зина нспольз1,5 мг фермента на г ся к области хинно к способу попу ого нного субтиди е при печени гнойныхиковална пр Известен способ получения препарата ммобилизованного субтилизина путементной иммобилизации субтилиэинаиродном полимере ЦДля этого к 100 мг диазотированного аминоарильного производного крахма. ла, суспензиромнного в 4 мл 0,1 М фосфвтного буфера (рН 7,8), медленно прибавляют 3 мл 0,5%-ного раствора субтилизина в том же буфере, Реакцию проводят при церемешивании в течение 16 ч при 4 С. Дпя отделения неиммобилизованного белка нерастворимый препарат отфильтровымют на воронке Бюхнера, промывают раствором КС, а затем дистиллированной водой. Полученные препараты содержат 1- рвммносителя.Недостатками этого способа являютсясложная технология, невысокое содержание 5субтилизина в препарате, а также то,что смола на основе крахмала не является пленкообрвзующей и биорвэлагаемой,Известен способ получения препаратаиммобилизованного субтилизина путемковапентной иммобилизации субтилизинана карбоксиметилцеллюлоэе 21Для этого гидразид кислоты, полученной из нерастворимой карбоксиметилцеллюпозы, содержащей 3,2 миллиэквиввлента карбоксильных групп на грамм препарата, суспензируют в 0,5 К НСт, в затем к. суспензии по кетлям при интенсивном перемешиввнии добавляют 5%-ныйводный раствор ММОпри 0-2 оС, Попрошествии 20 мин реакцию заканчивают, промывая целлюлозный порошок на фильтре холодной дистиллированной водой. Полученный активироввнный носитель сразу помещают в 1%-ный раствор субтилизинв3 910667 4при РН 8,5. Реакцию проводят в течение шивают с 0,02%-ным водным раствором2 Препарат иммо-, субтилиэина, шт. 72, в объемном соотно 2 ч при перемешивании. репа ат ибилиэованного субтилизина промывают на шенин, равном 0,25. Полученный растворфиль МОЮ и дистиллирован- переносят в кювету из плексиглаза и су-фильтре растворомной водой. Препарат содержит 60 мг . шат при 25 фС в течение 2 дней, Высусубтилиэина на грамм носителя. щенную пленку, содержащую субтилизин,Недостатками этого способа Йпяются погружают в 1%-ный раствор глутаровосложная технология, невысокое содержа-го альдегида в фосфатном буферение субтилизина, а также то,что исполь- (рН 8,0) на 30 с при 250 С. Пленку отзуемый носитель не являетсяяется пленкообра й мывают от избытка глутарового альдегиэующим и биоразлагаемым. да дистиллированной водой, Полученныйпрепарат иммобилизованного субтилизинаНаиболее близким по технической содержит 10 мг фермента на 1 г колласущности и достигаемым результатамгена. Иммобилиэованный субтилизин хра-.(базовый объект) является способ полу з нят в сухом виде при 4 С.чения препарата иммобилизованного суб- П р и м е р 2. 0,5 -ный раствор колтилизина путем ковалентной иммобилиза- лагена, предварительно отдиалиэованиыйции субтилизина на природном полимере - против дистиллированной воды, смешивадиэтиламиноэтилсефадексе 33 ют с 0,32%-ным раствором субтилизина,,ДЭАЗ-сефадекс,предварительно акти шт, 72, в объемном соотношении, равномвированиый бромцианом, помещают в 20. Полученный раствор переносят в кю 1 -ный раствор субтилизина при,рН 10,0. вету иэ.плексиглаза и суш рРеакцию проводят в течение 20 час при в течение 5 дней. Высушенную пленку,4 С и постоянном перемешивании. Полу- содержащую субтилиэин, погружают вченный продукт промывают 1 М МСВ, д 10% ный раствор глутарового альдегида0,1 М УНСО и дистиллированной водой. в фосфатном буфере (РН 7,0) н0 на 60 сПрепарат иммобилиэованного субтилиэина при 17 С. Пленку отмываюто от избыткасодержит 23 мг фермента на грамм но- глутарового. альдегида дистиллированнойводой. Полученный препарат иммобилизоНедостатками этого способа являются Е ванного субтилизина содержит 12 мг ысложная технология, включающая исполь- тивного фермента на 1 г коллагена. Имэованиеование токсичного бромциана, невысокое мобилизованный субтилизин хранят в су 0содржание субтилизина в препарате и то, хом виде при 4 С.что ДЭАЭ-целлюлоза не является пленкоП и м е р 3. 0,6%-ный растворобразующей и биоразлагаемой. Ро йБелью изобретения является п чолу ение коплагена предварительно отдиалиэованныби азлагаемого пленкообразующего прь- против д ст ироистилл ванной воды, смешиваиорапа та, повышение содержания субтилизи- ют с 5- м дкь р ворм,ш во м аствором субтипишт. 72 в обьемном соотношении,на в препарате и упрощение технологии зина,раином 4. Полученный раствор переносятпроцесса.46а и сшат иполучения препарата иммата иммобипиэованного 20 С в течение 3 дней. ысушеннуютилизинатем ковапентной иммоби- пленку, содержащую субтипиэин, погружал изации субтилизина на природном полимере 0,02-5%-ный водный раствор суб- дегида в фосфатном буфер Р еом б е ( Н 7,8) иаешивают с 0,5-2,5% ным30 с при 25 С. Ппекку отмывают оттилизина смешивают с, -, нымг а ваго альдегида дистилпидным раствором коллагена в объемном избытка глутаровоговодным ротношении 0,25-20, воду удаляют испа- рованной водой. Полученны р рченный п епа ат имрением при - , и пи 17-250 С и полученную плен- мобилизованного субтилиэина содержитого еща на 1 г колоб абатывают 1-10%-ным водным 340 мг активного фермещаку ра атыв%0 И обипизованиый субтилизинраствором г тпу арового альдегида в тече- лагена. Иммобипиз убто ие и 4 С.30-60 с при РН 7-8 и 17-25 фС, хранят в сухом виде приПеред использованием для удаления Полученные препараты иммобилизованя ных примесей раствор кол- ного субтилиэина исцопьзуют пр пече;.низкомопекулярных про но-мьпиечных гиойлагена отдиапииапизовывают против дистилли- нии плоскостных кожно- еных ран в межлопаточиой области кролированной воды.Пример ., ны Р1 2 5%-ный аствор ков. Все препараты полностью растворяколлагена, пред редварительно отдиалиэован- ются в течение одних суток, уменьшаяиый против дистиллированной воды, сме- время очищения н заживлении раны.5 910667Таким образом, и, оведеиие процесса, нием при 17-25 оС и полуеннуо пленку. по способу изобретения позволяет унрособрабатывают 1-10 Ь-ным водным расьтить технологию получения препарата вм- . вором глутарового альдегида в течение мобилизованного субтилиэина, повысить 30-60 с при рН 7-8 и 17-25 оС. содержание субтилизина в препарате.и. Источники информации, получать биоразлагаемые пленкообраэую- принятые во внимавие при экспертизе.ф шие препараты. 1. .6 о 1 двйе 1 п апд ойЬегя,иайег 1 пзо 1 цЫе едущее. 5 упйЬеа 1 в оУ а ахеисе г г 1 ег аеф 1 йа ц й 111 ха й 1 оп аког рге"ф о р м у л а и з о б р е т е н и и16 рагас 1 оп 01 1 мо 1 цЫе дег 1 чаОчевоГ рара 1 н, йгура 1 п апд ыЬФ 11 орерй 1- Способ получения препарата иммоби- даве А, 91 осЬна 1 вйгу, 1970 9 2322- лиэованного субтилиэина путем ковалеит-2334.ной иммобилизации субтилиэина на при-2.и. Вгцапег аЫ,огйегв, Ргерагайоп родном полимере, о т л и ч а ю ш и й - о апд ргорегй 1 ев оФ сагг 1 ег-Ьопд ейку":" с я тем, что, с целью получения биораэ- вел, Еиг.4. 61 осЬеа., 1972, 25, 129- лагаемого пленкообразуюшего препарата,135,повышения содержания субтипиэина в пре. Е, 5 чепвяоп, Ргерагай 1 оп аль парате и упрощения технологии процесса, епгупай 1 с ргорегФ 1 ев о 1 аиЬФ 111 в 1 п 0,02-5,0%-ный водный раствор субткли- щ йочо сйеа 1 са 11.у аИасЬед Фо эо 1 цЫе зина смешивают с 0,5-2,5%-ным водным ОЕАЕ-дехйгап аа 1 1 пяо 1 цЫе ВРЕ-зерраствором коллагена в объемном соотно- Ьадей, В 1 осЬеа, 81 орйув. Асйа, 1978, шенин 0,25-20, водуудаляют испаре-492, 954-963.Составитель Л, ВалуевРедактор О. Юрком ТехредЛ. Пекарь Корректор Н, СтепЗаказ 1023/27. Тираж 512 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж 35, Раушсная наб., д. 4/5филиал ППП фПатентф, г. Ужгород, ул, Проектная, 4