Способ получения вакцины против клещевого энцефелита

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСЖОМУ Сви ИТИЗЬСТВУ Союз Советских .СоциалистическихР.ес публик и 660389(22) Заявлено 2303 авт. саид 5/00 йем зая с присоединен (23) ПриоритеОпублико осударствеиный комите СССР по делам изобретений и открытий.БЭльберт, .Г. Дроздов,Н .Л, К Гага Крут рать ева на, В,П, Грачев,ская, М.К. Ханина И.Д. Сперанская(71) Заявител ститут полиомиелита и вирусных энцефалитоАМН СССР 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КЛЕЩЕВОГ ЭНЦЕФАЛИТАосф ори ок ис" оэамещен 0,0 ернокисный 0 Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения противовирусной вакцины.Известен способ получения вакцины против клещевого энцефалита путем выращивания вируса-возбудителя в монослое культуры эмбрионов кур с последующей инактивацией вируса формалином и его осветления мало- скоростным центрифугированием вирусосодержащего материала (1.Однако известный способ не обеспечивает высокой иммунологической активности, чистоты и стабильности вакцины.Целью изобретения является повышение иммунологической активности, чистоты и стабильности вакцины.Эта цель достигается тем, что вы ращивание вируса проводят в объеме питательной среды 0,15-0,20 мл/см поверхности монослоя, содержащей (в вес.%) гНатрий хлористый 0,64-0,68 Калий хлористый 0,035-0,045 Натрий фосфорнокислый двузамещенный двуводный 0,167-0,171(21) 2465987/28-13 (51) М. КЛ.ки Йо С 12 К02,80. Бюллетень Йо 8я описания 28,0280 Калий флый однный 073-0,0077Магний слый семивод , 008-0, 012Глюкоза 0,08-О,12Феноловый красный 0,0018-0,0022Натрий кислыйО углекислый 0,045-0,055После инактивации вируса его выделяют в процессе равновесного зо-нального ультрацентрифугирования вградиенте плотности сахарозы от 8до 60 вес .В с добавлением стабилизаторов, отбирают фракции от 33 до47 сахаровы,затем их объединяют иразводят.до 1 г 10-1 г 30 исходногообъема,Способ осуществляют следующимобразом.Во взвесь клеток, трипсинизированных 9-10 дневных эмбрионов кур,вносят в виде суспензии мозга зара 25 женных белых мышей вирус клещевогоэнцефалита штамм еСофьин илилюбой другой, подходящий для изготовления вакцины.Инфицированную клеточную взвесьразводят до концентрации 3 млн/млпитательной средой, состоящей из О, 5 гидролизата лактальбумина и 3 сыворотки крупного рогатого скота в солевом растворе Хенкса и высевают в 1-5-литровые круглые стеклянные бутыли, которые затем инкубируют при температуре 37 С в роллерной установке при скорости вращения 10-12 об/мин.Через 20 ч, когда образуется плотный клеточный монослой, питательную среду удаляют, культуру ткани промывают буферным солевым раствором следующего состава (вес .) БаСР О,ббр КСР 0,04 р БаНРО 4 2 Н 20 0,169 у КНРО 4 0,0075 Р МАЗО, 7 Н 20 001 Р глюкоза 0,1; Феноловый красный 0,002; УНСО 0,05; рН 7,7-7,8.Затем в бутыли заливают поддерживающую питательную среду в количестве 0,15-0,2 мл на 1 см 2 поверхности клеточного монослоя. Среда состоит из аминокислот и витаминов 2 О соответственно рецептуре среды 199 Паркера, человеческого альбумина в концентрации 0,1 и солей соответственно составу указанного буферного солевого раствора, рН среды 7,7-7,8. 25Через 40-48 ч инкубации при 370 С в роллерной установке в бутыли вносят стеклянные бусы, встряхивают до полного разрушения клеточного моно- слоя и затем переносят содержимое в подходящие емкостиПри хорошем качестве культуры ткани производят двойной сбор вирусосодержащего материала: через 20-24 и 40-48 ч. В этом случае .производят полную замену поддерживающей питательной среды после первого сбора, клеточный моно- слой разрушают при втором сборе.К собранному материалу прибавляют формалин в концентрации 0,05, смесь инкубируют для инактивации ин фекционности при 32 С в течение 72 ч, После этого материал подвергают предварительной очистке методом проточного центрифугирования при 6000- 10000 ц, а затем концентрируют и 45 освобождают от белковых и других примесей на проточной ультрацентрифуге методом равновесного зонального ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахароэы 8-60 вес., фактор разделения 90000 Ч.,Растворы сахарозы готовят на буфеое следующего состава: М (моль) ИаСЙ 0,1 р ИаНРО 4-КН 1 РО 4 0,01 р версен 0,001. К этому раствору для стабилизации вирусных антигенов прибавляют формалий 0,05 и человеческий альбумин 0,1 . После того как весь материал пропущен через ротор ультрацентрифуги, 60 вращение ее поддерживают в том же скоростном режиме еще 1 ч, затем вращение замедляют или прекращают.полностью и фракционно извлекают содержимое ротора. После рефрактоПредлагаемый способ обеспечивает получение вакцины повышенной иммуногенности, очищенной от белковых и других примесей, стабильной в процессе хранения и транспортировки. Формула изобретения Способ получения вакцины против клещевого энцефалита путем выращивания вируса-возбудителя в монослое культуры эмбрионов кур с последующей инактивацией вируса формалином и его осветления центрифугированием вирусосодержащего материала, о т л ича ю щи й с я тем, что, с целью повышения иммунологической активности, чистоты и стабильности вакцины, выращивание вируса проводят в объеме питательной среды 0,15- О, 20 мл/см пов ерхности монослоя,йсодержащей (в вес,):Натрий хлористый 0,64-0,68Калий хлористый 0,035-0,045Натрий фосфорнокислый двузамещенный двуводныйКалий фосфорнокислый одноэамещенный О, 0073-0,0077Магний сернокислый семиводный 0,008-0,012Глюкоза 0,08-0,12Феноловый красный 0,0018-0,0022. Натрий кислыйуглекислый 0,045-0,055после инактивации вируса его выде 0,167-0,171 метрического определения концентрации сахарозы в полученных фракциях отбирают те, которые содержат от 33 до 47.вес. сахароэы. Эти фракции объединяют и разводят средой 199 Паркера таким образом, чтобы конечный объем составил 1:10-1:30 от объема всего использованного для ультрацентрифугирования вирусосодержащего материала, прибавляют,: желатин 1,0; амино-пептид АП5,0; формалин 0,05 и мертиолат 0,01, разливают во флаконы или ампулы, замораживают при температуре ниже точки эвтектики и подвергают лиофильному высушиванию.Полученный препарат является готовой Формой вакцины клешевого энцефалита культуральной, очищенной, концентрированной, убитой, сухой для профилактики заболевания людей. Вакцину хранят и транспортируют в этой форме и непосредственно перед употреблением растворяют специальным растворителем, содержащим в дистиллированной воде 1-2 мг/мл гидроокиси алюминия.Вакцину вводят под кожу в объеме0,5-1,0 мл.660389 Составитель С. МалютинаТехред М.Келемеш Корректор Е, Папп Редактор Н. Белявская Заказ 10066/6 Тираж 522 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная,4 ляют в процессе равновесного зонального ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахароэы от 8 до60 вес .В с добавлением стабилизаторов, отбирают фракции от 33 до47 сахарозы, затем их объединяют и разводят до 1 ф 10-1:30 исходногообъема,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССР5 9 167967, С 12 К 5/00, 1964,