Способ получения -аспарагиназы

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН И Я Союз Советских Социалистических Республик(43) Опубликовано 28.02.79, Б 1 оллетень ЪЪ 8 (45) Дата опубликования описания Об.04.79 СССР делам изобретени) Заявитель нститут микробиолог 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ .-АСПАРАГИНАЗ 1 МЕДИ 1 Я фЕРреду очпсмолой, а добавляют ет анкти 1 достижения питательна 1 шенпя ком ение в распроых тка- бактеПентозосодержащий гплизатСоль аммонияОднозамещенный фосфнокислый калийДвузамещенный фосфонокислый калийСернокислый магнийДрожжевой экстрактВода 0,3 -0,7 в 1,40,02 - 0,0 1,0 - 4,0Остально т ществляют овят на я щего сь лизатов р П 1 дро опковой ьев, обреподсол не-зелень основе рьярастилпзатог шелухи. зков винеч ника, 1 Х ВОДО. Изобретение относится к област цины, а именно к способам получен мента (.-аспарагиназы.Фермент 1,-аспарагиназы облад тплимфомной и иммуносупрессорной ностью, что определяет его приме 1 медицине. (.-аспарагиназа широко странена в животных и растительн нях, микроорганизмах, в том числ Известен способ получения 1.-аспарагиназы путем аэробного глубинного культивирования культуры ЕгМп 1 а саго 1 оюга на питательной среде, содержащей источник углерода, дрожжевой экстракт, сернокислый магний, двухзамещенный фосфорно. кислый калий, однозамещенный фосфорно- кислый калий, соль аммония и воду 111.Недостатками известного способа являются высокая стоимость препарата, 2 сравнительно низкие активность и выход 1.- аспарагиназы.Целью изобретения является интенсифи. кация процесса, увеличение выхода фер. мента и расширение сырьевой базы. 2Для достижения поставленной цели в качестве источника углерода используют пентозосодержащие гидролизаты растительных отходов с соотношением ксилозы и глюкозы О,б: 1 - 7: 1, при этом последние пе ед введением в питательнующают активированным углематем в очищенный растворкись кальция.Окись кальция вводят доН очищенного раствора б,8, ареда имеет следующие соотнонентов, вес. 0(о 0,Предлагаемыи спосооследующим образом.Питательную среду готдоступного и недорогостопентозосодержащих гидротельных отходов, напрпмекукурузных кочерыжек, хлотходов лиственных деревноградной лозы, стеблейкостры льна и конопли, сп1 О - 20% от максимального насыщения, температура 30 - 40 С (оптимум 37 С).Пецогасспель - силикон ЭПОили подсол ссе цсое масло - вводят в количестве 0,01% 5 при необходимости.В ходе ферментации контролируют рН,рО прирост биомассы, удельную активцосгь /,-асцарагиназы. На 8 - 16 ч роста в условиях периодического культивировас 0 ис получают биомассу Египса саго 1 оога2 с.З со средней удельной активностью Е-аспарагиназы 8 - 15 МЕ/мг сухого веса и выходом фермента 20 - 73 МЕ/,пл среды.По окончании ферментации биомассу С 5 сепарируют для выделения фермента. Быде.ссццс У.-аспарагцназы из клеток осуществлясот одним из известных способов.П р и м е р 1, Посевной материал Его- пса саго 1 оога в количестве 0,01% исполь зуют для засева колб емкостьо 250 лсл с50 .цл среды следующего состава, вес. %: л 5 0,5 0,5 1,0 - 4,0Остальное 0,3 Перед приготовлением среды гидролнзаты подвергают очистке с помосцьсо активнрованного угля и смолы КУи усреднению до рН 6,8 окисью кальция.Исходную культуру размножают на агаровых косяках, инкубируют в течение 24 ч в термостате при 37" С.Продуцент сохраняют на агаризованных (2% агара) средах; МПА (мясо-пептонный агар) или дрожжевой среде с глутамсцсом (2 и 0,5% соответственно), Культуру хранят при комнатной температуре ( +20 С), пересевают через каждые 3 месяца.Для выращивания посевного материала применяют среду, по составу аналогичную составу ферментационной среды. При этом в качестве источника углерода используют :Э-кссслозу в количестве 1%. Использование посевного материала, проадаптированного ; основному источнику углерода пентозосодержащего сырья, обеспечивает интенсивный рост продуцента в процессе ферментации без заметного лаг-периода. Продолжительность выращивания посевного материала 16 - 24 ч.Для засева ферментационной среды используют 0,01% посевного материала (по сухому весу).Ферментацию осуществляют в фермснтерах объемом 4 л с рабочим объемом ферментационпой жидкости 2 л, Среду стерилизуют 40 - 60 мин при 1 ат,сс, Условия ферментации: рН среды 6,8 - 7,0 поддерживают 5% МаОН, рО поддерживают на уровне 0,70,021,0Остальное. Перед введением в среду гидролизатобрабатывают активированным углем и смолой КУ, усредняют до рН 6,8 окисью 40 кальция.Условия культивирования; рН 6,8 - 7,0,в процессе ферментации не регулируется, температура 37 С, скорость качалки 220 об/яин, продолжительность выращивания 45 16;. 13 конце ферментации получаютбиомассу с удельной активностью Е-аспарагиназы 8 МЕ/,яг.При м е р 2, Посевной материал ЕгМпса саго 1 оога в количестве 0,01% исполь зуют для засева ферментеров емкостью4 л с 2 л среды, содержащей компоненты по примеру 1. В качестве источника углерода использусот гидролизат хлопковой шелухи (Ферганский химический завод фура новых соединений) в количестве 1,3% поксилозе, соотношение ксилозы и глюкозы 5,3: 1. Перед введением в среду гидролизат обрабатывают активированным углем и смолой КУ, усредняют до рН 6,8 окисью 00 кальция. Условия выращивания: рН среды6,8 - 7,0, температура в процессе ферментации 37 С, аэрация на протяжении всего процесса; р 02, равное 10 - 20% от максимального насыщения. После 15 ч фермен тацин получают биомассу с удельной активрослей, смеси сине-зеленых водорослей с подсолнечной лузгой и др.Пентозосодеряащие гцдролизаты расти. тельных отходов представляют сло кпыс смеси пентоз (ксилозы и арабцнозы) и гексоз (глюкозьс и рамнозы). Соотношение ксилозы и глюкозы колсолстся в пределах 0,6: 1 - 7: 1, оптимум 4: 1 - 7: 1.Из неорганических солей используют фосфаты, соли магния и аммония. Источником амицного азота служит кукурузный экстракт, дро;с(жевой экстра(т, гссдро,цзат ;цпа ВВК, гцдролизаты белков и др.Согласно изобретению, фермснсация ведется в питательной среде следусощего состава, вес. %: Пентозосодержащий псдролизат (по ксилозе) 0,5 - 1,5 Однозамещенный фосфорнокислый аммоний 0,3- - О,о Однозамещецный фосфорнокислый калий 0,3-0,6 Двузамещенный фосфорнокислый калий 0,7 в 1,4 Сернокислый магний 0,02 - 0,05 Дрожжевой экстракт (илидругой источник аминного азота)Вода Гидролизат костры льнаи конопли (по с(силозе)(соотношение ксилозы иглюкозы 0,6: 1)Однозамещенный фосфорнокислый аммонийОдноза мощенный фосфорнокислый калийДвузамещенный фосфорнокислый калийСернокислый магнийДрожжевой экстрактВода649746 с 1 з о р м у л и и з о б р е т с н и я ПентозосодержащийгидролизатСоль аммония Однозамещенный фосфорнокислый калий Двузамещенный фосфорнокислый калий Сернокислый магний Дрожжевой экстракт Вода 0 Л - 1,5 0,3 - 0,5 30 0,3 - 0,6 0,7 в 1,40,02 - 0,051,0 - 4,0Остальное Составитель Т. СеребренниковаТехред Н. Строганова Корректор И. Симкнна Редактор Е. Дайн 3 аказ 50 161 Изл. М 172 Тираж 543 Г 1 одиисное НПО Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва Ж, Раушская наб., д. 4/5Тип. Харьк. фнл, пред. Патент ность;о 1 -аснарапшазы 12,9 МЕ/лг сух. веса и выходом фермента 72,5 МЕ,игл среды.П р и м ер 3. Посевной материал Егг 1- ша саго 1 оуога в количестве 0,01% используют для засева ферментеров емкостью 4 л с 2 л среды, содержащей компоненты по примеру 1, В качестве источника углерода используют гидролизат кукурузных кочерыжек (Краснодарский химический комбинат) в количестве 1,1% по ксилозе, соотношение ксилозы и глюкозы в гидролизате 3,8: 1. Перед введением в среду гидролизат обрабатывают аналоп 1 чно примеру 1. Условия выращивания: рН среды 6,8 - 7,0, температура в процессе ферментации 37= С, аэрация на протяжении всего процесса, рОз, равное 10 - 205/, от максимального насыщения. После 15 ч ферментации получают биомассу с удельной активностью Е-аспарагнназы 15,4 МЕ/лгг сух. веса н выходом ферме 11 та 73 МЕ/чл среды.П р и м е р 4. Биосинтез Е-аспарагнназы производят на среде, содержащей в качестве источника углерода гидролнзат отходов лиственных деревьев в количестве 1 в/о по ксилозе, соотношение ксилозы и глюкозы в гидролизате 7: 1. После 16 ч ферментации получают биомассу с удельной активностью Е-аспарагиназы 12,8 МЕгяг сух. веса и выходом фермента 60 МЕ/лл среды. Использование предлагаемого способа получения Е-аспарагпназы на основе пентозосодержащих п,дролнзатов растительных отходов дает значительное повышение выхода фермента и значительное снижение себестоимости готового продукта, обоснованное разницей стоимости чистых сахаров (ксилоза - 25 рггб/кг) и сахаров гидролпзатов (0,15 - 0,25 рг/б/кг) . 1. Способ получения Е -аспарапшазыпутем аэробного глубинного культивирования культуры Егг 1 п 1 а саго 1 очога на питательной среде, содержащей источник углерода, дрожжевой экстракт, сернокнслый магний, двузамещенный фосфорно кислый калий, однозамещенный фосфорнокнслый 10 калий, соль аммония и воду, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что, с целью интенсификации процесса, увеличения выхода фермента и расширения сырьевой базы, в качестве источника углерода используют пентозо содержащие гидролизаты растительных отодо с соотошснием 1 силозы н глгокозы 0,6: 1 - 7; 1, при этом последние перед введением в питательную среду очищают активированным углем и смолой, а затем в очи щеннь 1 й раствор добавляют окись кальция.2. Способ по п. 1, отличающийсятем, что окись кальция вводят до достижения рН очищенного раствора 6,8.3. Способ по п. 1, отличающийся 25 тем, что питательная среда имеет следующие соотношения компонентов, ьсс, сз: Источник информации, принятый во40 внимание при экспертизе: 1. Авторское свидетельство СССР438684, кл, С 12 Р 13/10, 1973.