Способ получения пре-мрнк из органов эукариот

) 639897 ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Со 53 Советских Социагистнческих Республик(51) Ч КлеС 07 Н 21 О нением заяв рисое осударственный комитет риоритет ллстснь М 48ано 30.12.78.(45) Дата и открыт бликования описания 30.12.78 Авторыизобретения(71) Заявитель й Московский государственный ордена Лен институт им. Н, И, Пирогова ме ицинскИзобретение относится к усовершенствованному способу получения пре-мРНК и мокнет использоваться для изучения биосинтеза информационной РНК, как в норме, так и при различных патологиях, при б действии фармакологических препаратов и других биологически активных веществ.Известен способ получения пре-мРНК пз органов эукариот, вклточающий гомогепизацию в растворе хлористого натрия, до бавленпе фенола, нагревапие смеси до 50 - 55 С, цсптрпфугпрование ее, последующее отделение ш:терфазного слоя, который суспендируют в растворе хлористого натрия, смешивают с фенолом. Смесь нагревают до 15 62 - 64 С, цснтрифугируют, отделяют водный слой, а иптерфазный слой повторно суспендпруют в смеси раствор хлористого натрия-фспол-додецилсульфат натрия, нагревают до 83 - 85 С, центрифугируют, от деляют водный слой.Из полученных водных слоев оделяют белковые примеси обработкой фенолом, додецилсульф атом натрия, хлороформом, цептрифугируют и образующиеся водные 2 слои обрабатывают этанолом 11.Однако известный способ не пригоден для выделения пре-мРНК из клеток лпмфопдной ткани, так как РНК деградирует по делам изобретений(43) Опублик пз-за атпвацпп рпоонулеаз, освоооькдаощпхся в процессе выделения,Цель изобретения - р.сшпрснпс сырьевой базы путем создания универсального способа, пригодного для получения нсдеградировапных прс-мРНК пз любых органов эукарпот, в том числе пз клеток Органов лпъфатическо спстюы: селезсгкп, тпмуса, лимфатических узлов, увеличение выхода п качества целевого продукта и достижение полного молекулярного состава пре-м РН К.Поставленная цель достигается гомогенпзацией ткани в присутствии 5 - 10% фикола, экстракцпей 1-НК с добавлением диэтплппрокарбопата 0,2 - 0,3 об. %, пнактпвацпей оставшихся рпбонуклеаз с помощью дополнительной оораооткп диэтнлпирокарбопатом на стадии удаления белковых примесей.11 о предлагаемою способу получения пре-мРНК пз органов эукариот гомогенпзацию ткани ведут в растворе хлористого натрия в присутствии 5 в 10 о фикола, добавляют фенол, нагревают до 50 - 55"С, центрифугируют ее, отделяют интерфазньш слой, который суспендпруют в растворе хлористого натрия в присутствии дпэтнлппрокарбоната (ДЗП) в концентрации от0,2 до 0,3 об, /смешивают с фенолом. Смесь нагревают до 62 - 64 С, центрифугируют, отделяют водный слой, а интерфазный слой повторно суспендируют в смеси раствора хлористого натрия-фепол-додецилсульфат натрия (ДДС - 1 Ча) в присутствии 0,2 - 0,3 об. /, ДЭП, нагревают до 83 - 85 С, центрифугируют, отделяют водный слой, и из полученных при этом водных слоев, предварительно инактивируя оставшиеся рибонуклеазы с помощью ДЭП в концентрации 0,2 об, "/О, отделяют белковые примеси обработкой фенолом, ДДСЬ 1 а, хлороформом, центрифугируют и образующиеся при этом водные слои обрабатывают этанолом.Пример 1. Для получения пре-мРНК из селезенки мышей 6 г ткани гомогенизируют в 0,25 мл 0,14 М раствора хлористого натрия, содержащего 10/о фикола (рН 6,8 - 7,0). Гомогенизацию проводят при 2 - 4 С в стеклянном гомогенизаторе со слабо- притертым пестиком. К гомогенату добавляют 75 мл 0,14 М раствора хлористого натрия, 100 мл охлажденного водонасыщенного фенола (рН 6,2), встряхивают в течение 15 мин при 50 - 55"С, охлаждают до 12 - 16"С и центрифугируют (15 мин, 5000, 4 С). Образуется 3 слоя. Верхний (водный) и нижний (фенольный) слои отбрасывают (фенольные слои отбрасывают и после каждого следующего центрифугирования), Отделенную интерфазу - белый, плотный слой - суспендируют в 50 мл 0,14 М раствора хлористого натрия, содержащего 0,2 мл 50 О/О-ного раствора ДЭП в этиловом спирте (конечная концентрация ДЭ 11 составляет 0,2 об. "/О). Смесь встряхивают при 35 - 40 С в темноте, добавляют 50 мл фенола, инкубируют при 62 - 64"С, энергично встряхивая 15 мин, охлаждают до 12 - 16 С и центрифугируют при указанных условиях. После центрифугирования водный слой, содержащий стабильную пре-мРНК и некоторое количество растворимых белков, подвергают депротеинизации. Интер- фазу суспендируют в 50 мл 0,14 М раствора хлористого натрия, содержащего 0,2 об. О/О ДЭП и 0,7 О/О ДДС-Иа и добавляют 50 мл фенола, Смесь встряхивают 15 мин при 83 - 85 С и после центрифугирования отбирают водный слой, содержащий лабильную пре-мРНК.Удаление из препаратов РНК рибонуклсаз и других белковых примесей (депротеинизацию) проводят следующим образом, К 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 водным фазам, содержащим стабильнуюи лабильную пре-м 1 НК, добавляют50 О/О-ный спиртовой раствор ДЭП до конечной концентрации 0,2 об, /О и перемешивают 1 - 2 мин при 18 - 20 С. Затем прибавляют раствор ДДС-а до конечной концентрации 0,5/о и 50 мл фенола. Смесьвстряхивают 15 мин при 2 - 4 С, центрифугируют и отбирают верхний, водный, слой,который подвергают дальнейшей двухкратной депротеинизации последовательным добавлением 50 мл смеси фенол-хлороформ(1:1) и 50 мл хлороформа.Для получения натриевой соли пре-мРНКк водным слоям (после всех депротеинизаций) добавляют по 150 мл охлажденногоэтилового спирта и оставляют при минус10 - 15 С для формирования осадка РНК.Исследование полученных РНК показало, что они относятся к классу пре-мРНКи получены в недеградированном состоянии.П р и м ер 2. Все процедуры проводят попримеру 1, но при концентрации ДЭП -0,3 об, е/О. При этом получают РНК с характеристиками по примеру 1.П р им ер 3. Все процедуры проводят попримеру 1, но для получения пре-мРНК берут 6 г печени мышей.Исследование полученных РНК показывают, что они относятся к классупре-мРНК и получены в неде;радирова ном состоянии. Так, исследование нуклеотидного состава показывает, что коэффициент специфичности, К=Г+Ц/А+У, дляРНК, выделенной при 63"С (пре-мРНКез )равен 0,95+-0,05 (п=10, уровень значимости 95 о ), а для РНК, выделенной при 85 С(пре-мРНКее ) - К=0,87+-0,07 (п=10,уровень значимости 95 О/О).П р и м ср 4. Все процедуры проводят попримеру 1, но для получения пре-мРНК берут 6 г лимфатических узлов мышей.Анализ полученных фракций показал;коэффициент специфичности дляпре-мРПКез; К=0,98-0,08; дляпре-мРНКее К=0,91+ 0,07 (и=10, уровень значимости 95/,).П р и м е р 5. Все процедуры проводят попримеру 1, но для получения пре-мР 1-1 Кберут 6 г тимуса мышей,Исследование полученных пре-мРНК показывает; для пре-мРНКез К=0,95 0,05;для пре-мРНКее К=0,89+-0,06.Количественный выход пре-мРНК (из 6 гткани) приведен в таблице.639897 РНК на 1 г сырой ткани по способу Ь 1 КГУвеличение выхода, фракция РНК Ткань предлагаемыйпрототип 255 пре-м РНКаз: пре-м РНКва 280 180 102 Печень (мыши) 155 153 145 пре-м РНКвз: п Ре " РН Ка 5: 210 4 д:д 60"= 7 Лимфатические узлы (крысы) 95 160 180 пре-и РНКвз, пре-и РНКв 1 110 60 60 д 81001035550 7 Лимфатические узлы (мыши) 120 185 25 г 1 пре-м РНКвз,пре-м РНКаа. Тимус (крысы) 115 170 215 110 70 пре-м РНКаз пре-м РНКаа 9510 14015 Селезенка (мыши) 170 Формула изобретения Составитель Л, Никулина Техред С. АнтипенкоРедактор А. Соловьева Заказ 2210/15 Изд, Ъв 769 Тираня 52 о Г 1 одписнос 11 ПО Государственного комитета СССР по делам изобретений н открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4 5Типография, пр, Сапунова, 2 Способ получения пре-мРНК из органов эукариот, включающий гомогенизацию в растворе хлористого натрия, добавление фе иола, нагревание смеси до 50 - 55 С, центрифугирование ее, последующее отделение интерфазного слоя, который суспендируют в растворе хлористого натрия, смешивают с фенолом, смесь нагревают до 62 - 64 С, 10 центрифугируют, отделяют водный слой, а интерфазпый слой повторно суспендируют в смеси раствор хлористого натрия-фенолдодецилсульфат натрия, нагревают до 83 - 85 С, цептрифугируют, отделяют водный 15 слой, и из полученных при этом водных слоев отделяют белковые примеси обработкой фсиолом, додсцилсульфатом натрия, хлороформом, цснтрифугируют и образующиеся при этом водныс слои обрабатыва ют этанолом, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода, повышения качества, достижения полного молекулярного состава пре-мРНК и расширения сырьевой базы, гомогенизацию ведут в присутствии 5 - 10% фикола, суспендирование проводят в присутствии дпэтилпирокарбопата в концентрации от 0,2 до 0,3 об. %, с дополнительной инактивацией оставшихся рибонуклеаз диэтилппрокарбопатом на стадии удаления белковых примесей. Источники инфо 1)хации,прииятыс во внимание при экспертизе 1. Лриои В. Я., Мантьева В. Л., Георгиев Г. П. Раздслсппс метаболпстически стабильной и лаби, - .ьиой информационных РНК ядер живот 11.1 х клеток, - Молекулярная биология, 1, М 5, 1967, с. 689 - 698.