Питательная среда для селекции этанол-усваивающих микроорганизмов

1 739103 Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик ОПЙСИИЕИЗОБРЕТЕМ ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(28) Приоритет во делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения С. П, Коваленко, О. Н. Замбржицкий и В. С. Шевчук Институт микробиологии АН Белорусской ССР(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ЭТАНОЛ-УС ВАИВАЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ и трудоемкость этих испытаний являются серьезными недостаткамит устраняемыми лишь в тех редких случаях когда возможно применение селективных питательных сред на этапе клонирования.Известна питательная среда для выращивания этанол- усвацвающнх микроорганизмов, содержащая этанол в качестве единственного источника углерода, источники других элементов, в частности, калий фосфорнокислый од. нозамещенньш, натрий фосфорнокислый двузамещенный, маггв 1 й сернокислый, а также агар, мочевину и воду 1.Однако использование этой пцтателыой среды в селекции этанол-усваиваю 1 цих микроорганизмов не позволяет достаточно эффективно находить наиболее быстро растущие мутантные формы по указанным причинам.Целью изобретения является ускорение процесса селекции и обеспечение возможности отбора наиболее быстро растущих мутантов этанолусваивающих микроорганизмов.Поставленная цель достигается тем, что питательная среда, включающая этанол как единИзобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для селекционного улучшения продуцентов кормового белка.Одним из путей повышения продуктивности5 микрооргатизмов является увеличение скорости их роста. Селекция микроорганизмов, направленная на увеличение скорости роста, как и любая другая селекция по количественным признакам, представляет собой трудоемкий и дли 1 О тельный процесс. Первым этапом этого про.цесса является выращивание селектируемой культуры на плотной среде, которая позволяет расти всем жизнеспособным особам данного микроорганизм; Отбор более продуктивных15 мутантов выполняется только на втором этапе, заключакипемся в индивидуальном испытании каждого клона по селектируемому признаку.Несмотря на предварительное воздействие на исхо,тзьш микроорганизм высокоактивных мутагеновт более продуктивные мутанты встречаются очень редко, их колонии внешне ничем не отличаются, а поэтому для их поиска испытанию подвергаются сотни клонов. Длительность Бкуллетень21 . (53) УДК 663,110 15 Таблица 1 Активность АДГ Удельная скорость роста Исследуемыйштамм 1 ч%отм. исходной культуры единицмг белка 2,20 + 0,08 149,7 0,39 + 0,018 150,0 Мутант 5 1,87 + 0,11 127,2 142,3 1,84 +,0,15 125,2 0,35 + 0,021 0,26 + 0,003 130,8 Мутант 14 1,47 + 0,10 100,О 100,0 Исходный 3 739103 ственный источник углерода, необходимые минеральные соли и агар, дополнительно содержит иодуксусную кислоту (ИУК) в качестве . ингибитора алкогольдегидрогеназы (АДГ) в концентрации, достаточной для торможения роста исходного микроорганизма. Входящие в питательную среду компоненты находятся в следу.ющем соотношении, вес.%:Этанол 0,7-1,5Калий фосфорнокислыйодно замещенный 0,25 - 0,3Натрий фосфорпокислыйдвузамещенный 0,5-0,бМагний сернокислый 0,1 - 0,13Мочевина 0,19 - 0,34Иодуксусная кислота 0,1 -0,8Агар 1,5-2,0Вода Остальное Предлагаемая среда является селективной и способствует росту только тех клонов исходного микроорганизма, которые обладают повышенными скоростями роста по сравнению с основной массой клеточной популяции.Введение в среду иодуксусной кислоты в качестве селектирующего агента обусловлено следующими теоретическими предпосылками. К увеличению скорости роста микроорганизмов на этанол-содержащих средах должны проводитьмутации, способствующие повышению продукциизп Мутант 11 0,37 + 0,013 Готовят предложенную питательную средуследуюгцим образом. Входящие в ее состав компоненты, вес.%;КН 2 1 О 4 0,25 - 0,3Мат НР 0412 Н 20 0,5-0,6Мд 8047 Н, О 0,1 - 0,13Мочевину 0,19 - 0,34Иодуксусную кислоту 0,1 - 0,8растворяют в необходимом количестве водо.проводной воды, нейтрализуют с помощьюМаОН до рК 7,0, добавляют 1,5 - 2,0 вес.% 4ферментов, катализирующих процессы превращения этанола в органические компоненты клеток,и в первую очередь алкогольдегидрогеназы(АДГ) первого фермента этой цепи процессов.Известно, что иодуксусная кислота являетсясильным ингибитором АДГ, связываясь с суль.фгидрильными группами активного центра этого фермента. Действие иодуксусной кислоты,в отличие от ее производных (эфиров, амида),достаточно специфично, т.е. кроме АДГ, этакислота действует еще на один фермент (участвующий в процессах усвоения сахаров). На сре.де, единственным источником утлерода в кото.рой является этанол, в присутствии иодуксуснойкислоты могут расти лишь такие мутанты, ко.торые производят АДГ в количестве большем,чем данная концентрация иодуксусной кислотыможет не активировать. Повышенная продукцияЛДГ должна обеспечивать этим мутантам болеевысокую скорость роста на этанол.содержащейсреде и в отсутствии ингибитора, Выделенныес помогцью предлагаемой среды быстро растущие мутанты этанол.усваивающих дрожжейСапйба гедвпу 316 производят значительнобольше алкогольдегидрогеназы, чем исходнаякультура,В табл. 1 представлены величины удельной скорости роста (м) и активности алкогольдегидрогеназы. агара, стерилизуют вйавтоклаве при 120 С в течение 20 мин, охлаждают до 50 - 70 С и добавляют в стерильных условиях 0,7 - 1,5 - вес,% 96%-ного этилового спирта.П р и м е р 1. Селекция микроорганизмов. В качестве селектируемого материала используют суепензию клеток дрожжей Сапд- да гвдо 1 пу 316, выращенную культивированием в течение 16 ч при 28-30 С на жидкой питательной среде следующего состава, г/л:этанол 15, КйрРО 4 3, 1 ча 2 НРО 412 Н, 0,6, МдВО 4 7 НО 1,3, мочевнна 1,9, водопроводнаяДальше все по примеру 1.В табл. 2 представлены данные по распре.делению величин ул среди клонов, отобранныхна сравниваемых питательных средах. Та блица 2 Процент клонов, обладающих данной величиной и Величины удельнойскорости роста (и )ч Среди отобранных на предлагаемой питательной среде Среди отобранных на питательной известной среде апбйаедопу316 Сапа 1 а Ас 1 петоЬастег са 3 соасет 34 сеетоЬастегса 3 соасет 34 гедшп 316,45 - 0,50 0,50-0,55 1,5 0,55 - 0,60 В результате испытания значительно больше. выделенных на известной среде (их исследовачисла клонов исходной дрожжевой культуры, но 60), не выявлено ни одного клона с вели 5 739103вода - до 1 л. Для увеличения генетическогоУразнообразия суспензия клеток может бытьобработана мутагенами. Затем неразведеннуюсуспензию высевают по 0,1 мл на чашки Петрис предлагаемой питательной средой следующегосостава, вес.%;Этиловый спирт 1,5КН РО 0,25Ма НРО 12 Н, О 0,5Мд 804 7 НО. 0,1 1 ОМочевина 0,19Иодуксусная кислота 0,8Агар 1,5Вода Остальное Через четверо суток культивирования при 30 С вырастают колонии устойчивых к иодуксусной кислоте мутантов. Частота их спонтан. ного возникновения у дрожжей Сапа 1 аа геди - 1 пу 316 составляет 3, 710 , а после предварительной обработки мутагеном (0,0025 М фа нетил-ди-хлорэтиламином) - 1,2510 . Колонии отсевают, очищают рассевом разведенных суспензий на предлагаемой среде. Высгвая полученные мутанты в колбы с жидкой питательной средой указанного состава и измеряя кон. 6центрацию биомассы каждого мутанта в процессе культивирования при 30 С, вычисляют удельные скорости роста (И ), Достаточно испытания 10 - 15 мутантов, выделенных на предлагаемой среде, чтобы найти несколько штам. мов, превосходящих исходную культуру по удельной скорости роста.П р и м е р 2. Селекция микроорганизмов. Густую суспензию клеток бактерий Ас 11- петоЬастег сасоасет 1 см 34, подготовленную по примеру 1, высевают на чашки с предлагаемой питательной средой, имеющей следующий состав, вес.%:Этиловый спирт 0,7 КН, РО 0,3 йа 2 НРО 4 12 Н 20 0,6 Мд 80 7 Н О 0,13 Мочевина 0,34 Иодуксусная кислота 0,1 Агар 2,0 Вода Остальное739103 05-0,60,1 - 0,130,19 - 0,340,1 -0,81,5-2,0Остальное Составитель .ПриваловТехред И,Асталош Корректор Г,Назарова Редактор П. Кравцова Заказ 3008/5 Тираж 522ЦНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж 35, Раушская цаб д 45 Подписное Филиал ППП "Патент" г. Ужгород, ул Проектная, 4 7чиной Ее, более 0,35 ч . В то же время из всех 16 мутантов, выделенных ца предлагаемой среде, обнаружено 4 клопа (25%), у которых Еевыше 0,35 ч . Из 50 клонов бактерий, выделенных ца известной среде нет ци одного с величиной д, превышающей 0,50 ч . Среди 26 клонов тех же бактерий, выделенных ца предлагаемой среде, 5 клонов (около 20%) имеют удельные скорости роста выше 0,50 ч, в том числе 2 клона, превосходящие исход О цую культуру по скорости роста на 77%. При селекции ца предлагаемой среде смешаются величины ротобранных клонов в большупг сторону, Если для выделенных на известной сре. де клонов дрожжевой культуры величины д лежат в пределах 0,15 - 0,35 ч , то у отобранных на предлагаемой питательной среде клонов - в пределах 0,25-0,40 ч. Среди клонов дрожжей, выделенных на предлагаемой питательной среде, це обнаружено такихкоторые имели щ бь: удельную скорость роста ниже 0,25 ч, хо. тя в исходной культуре дрожжей такие клоны составляют почти половину популяции, Аналогичная картина наблюдается и при селекции бактерий. 25Таким образом, у этанол.усваивающих микроорганизмов с помощью предлагаемой питательной среды возможно селективцое выделение мутантов, обладацлцих повьцце гной скоростью роста в результате увеличения продук ции алкогольдегидрогецазы, Эти мутанты способны ца предлагаемой питательной среде образовывать видимые колонии (в отличие от огромцого оольшицства представителей исходной культуры), а при глубинном культивировании ца жидкой питательной среде того же состава, цо це содержащей ицгцбитора АЛГ (и агара), обладают более высокими удельными скоростями роста, чем исходная культура,8Предлагаемая питательная среда для селекции этанол-усваювающих микроорганизмов значительно (в десятки раз) ускоряет процесс селекции и обеспечивает возможность отбора наиболее быстро растущих, а, следовательно, наиболее продуктивных мутантных форм. Формула изобретения Питательная среда для селекции этанолусваивающих микроорганизмов, содержащая этанол в качестве источника углерода, калий фосфорцокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокис. лый, мочевицу, агар и воду, о т л и ч а ющ а я с я тем,.что, с целью ускорения процесса селекций и возможности отбора наиболее быстро растущих мутантных форм микроорганизмов, оца дополнительно содержит иодуксусную кислоту в качестве ингибитора алкогольдегидрогецазы при следующем соотношении компонентов, вес.%:Этанол 0,7-1,5Калий фосфорнокислыйоднозамещенцый 0,25 - 0,3Натрий фосфорнокислыйдвузамещецныйМагний ссрнокислыйМочевицаИодуксусная кислотаАгарВода Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Коваленко С. П, и др, Выделение изприродных источников микроорганизмов хорошо растущих на некоторых Я, - соединениях, "Микробы и их метаболиты", Минск,1074, с, 126130,