Способ получения липосом

ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз Советских Социалистических РеспубликПриоритет 2) Государственный комитет Совета Министров СССР оо делам изаоретений и открытий43) Опубликовано 15,01.78.Бюллетень2 45) Дата опубликования описания 06, ОХ 7 Я( Франция) 2) Автор изобретен Иностранная фирмаБаттелле Мемориал Институт( Швейцария) 71) Заявител СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМ 2 получению лекаржаших биологируину и гидро- чтобы образо. л этой водной Изобретение относится кственных препаратов, содерчески активные вещества.Известен способ получения липосом, содержащих биологически активные вешества, например антибиотики и энзимы, заключающийся б в том, что водные растворы вешества смешивают с фосфолипидом и другими соединениями, например холестерином, токоферолом и смесь подвергают воздействию ультразвука, затем из озвученной смеси выделяют целевой продукт известными приемами 1.Однако этот способ является трудоемким, что создает трудности для его использования в промышленном масштабе.Для упрогцения технологического процесса по предлагаемому способу обработку ультразвуком осуществляют в присутствии органического растворителя с плотностью ниже воды, а затем к полученной дисперсии добавляют новую порцию воды и трехфазную систему подвергают центрифугированию.20Сначала диспергируют под действием ультразвука первую водную жидкость в жидкости, имеющей малую растворимость в воде или нерастворяющуюся в воде и плотность, меньшую, чем плотность воды в присутствии по крайней мере одного соединения, представляю щего гидрофильную полярную гфобную неполярную группу так,вать коллоидную дисперсию глобжидкости.Затем приводят эту дисперсию в контакт со второй водной жидкостью таким образом, чтобы образовать гетерогенную смесь, состояшую из верхнего жидкого слоя, образованного этой дисперсией и нижнего жидкого слоя, образованного второй водной жидкостью; эти два слоя разделены мономолекулярным слоем соединения Х-У, (где Х-гидрофильная полярная группа, У-гидрофобная неполярная группа) и подвергают эту смесь центрифугированию с достаточной угловой скоростью для того, чтобы частицы первой водной жидкости, диспергированные в верхнем слое, были увлечены под действием силы тяжести в нижний слой сквозь пленку соединения формулы Х-У, разделяющую эти два слоя.Таким образом, этот способ состоит из двух стадий. Во время первой стадии образуют под действием ультразвука, дисперсию глобул жидкости, заключаемой в капсулу; эти глобулы, имеющие коллоидные размеры 200 - 1000 А, находятся в жидкости нерастворимой или слаборастворимой в воде. Глобулы ограничены мономолекулярным слоем соединения Х-т, гидро588905 13 Ю а 30 35 46 45 фильные группы Х которого направлены внутрь глобул, которые заполнены водной жидкостью; гидрофобные группы У наоборот направлены к внешней части глобул, которая состоит из неводной фазы.Вторая стадия способа состоит в образовании чистых липосом. Это образование происходит потому, что, проходя через мономолекулярный слой соединения формулы Х.У, который находится на поверхности раздела фаз между слоем верхней неводной жидкости и слоем нижней водной жидкости, каждый предшественник липосом (глобула) вовлекает в себя часть этого слоя, который объединяется с мономолекулярным слоем соединения Х-У, который его ограничивает, образуя биомолекулярныйслой этого соединения, характеризуюший липосомы. В качестве соединения формулы Х-У используют, например, соединение, в котором гилрофильная группа Х представляет собой фосфатную, карбоксильную, сульфатную, аминную, гидроксильную или холинную группу, а гидрофобная группа У представляет собой насыщенную или ненасыщенную алифатическую углеводородную группу, например алкил или алкилен, алифатическую углеводородную, замешенную по крайней мере одним ароматическим или циклоалифатическим радикалом группу.Предпочтительно в качестве соединения формулы Х-У используют фосфолипид или вешество, близкое фосфолипидам, а именно лецитин, фосфатидилэтаноламин, лизолецитин, лизофосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит, сфингамиэлин. кардиолипин, фосфолипоидную кислоту и цереброзиды.В качестве соединения формулы Х-У можно также использовать смесь, по крайней мере одного фосфолипида и по крайней мере одного липида, принадлежащего к другому классу, чем фосфолипид, например стеариламин, дицетилфосфат, холестерин и токоферол,В качестве жидкости, слаборастворимой или нерастворимой в воле с меньшей плотностью, чем у воды используют бензол, галоид- или алкилпроизводные бензола, простой эфир алкиленоксида. а,ифатический кетон, алифатический адьдегпд, сложный алифатическии фир алифатический углеводород или циклоалифатический углеводород, или смесь нескольких соединений, имеющую плотность ниже, чем у воды.Предпочтительно использовать в качестве водной жидкости раствор по крайней мере одного биологически активного вещества, а именно энзима, лекарства типа антибиотика.В качестве второй водной жидкости используют чистую воду или любую другую подходяшую водную жидкость.Предпочтительно используют водный раствор хлористого натрия. Можно использовать водный раствор хлористого натрия, так называемый физиологический раствор, имеющий концентрацию 0,15 моля на 1 л (0,9 вес.%) с целью непосредственного получения во время второй стадии способа дисперсии липосом в среде для инъекции в человеческий организм. 4Выделить липосомы из второй волной жидкости можно любым из известных способов, например гель-хроматографией.Пример 1. Заключают в капсулы водный раствор амилоглюкозидазы, содержащий 10 мг амилоглюкозы в 1 мл раствора, в водном растворе хлористого натрия концентрации 0,15 моль/л.Сначала добавляют 54 мг лецитина и 0,1 мл указанного водного раствора амилоглюкозидозы к 3 мл дибутилового эфира и подвергают полученную таким образом гетерогенную смесь обработке ультразвуком в течение 2 мин, поддерживая температуру ниже 30 С с помощью охлаждаюшей бани. Получают прозрачную голеогенную жидкость, которая имеет синеватый отблеск. Осаждают слой этой жидкости в пробирке лля центрифугирования на слой от 1,5 мл водного раствора хлористого натрия концентрации до 0,15 моль/л. Получают двухфазную смесь, состоящую из нижнего слоя водной фазы (раствор хлористого натрия) и верхнего слоя органической фазы, полученной обработкой ультразвуком из смеси дибутилового эфира, лецитина и раствора амилоглюкозидозы. Подвергают эту двухфазную смесь центрифугированию со скоростью 30 000 об/мин в течение 30 мин, после чего выделяют верхний слой (органическая фаза) и подвергают нижний слой (водная фаза) новом, центрифугированию со скоростью 30000 об,мин в течение 30 мин. Получают прозпачнуго жидкость, слегка окрашенную в синий,;; Налет незчачительного объема, образованную недиспергированным липидом (лецитином), который удаляют. Эта прозрачная жидкость представляет собой суспензию липосом, имеющих коллоидные размеры, содержащую в себе водный раствор амилоглюкозидазы в 0,5 Л 1 водном растворе хлористого натрия, а также - небольпое количество амилоглюкозидазы, не заключенной вкапсулы.В зависимости от применения можно использовать эту суспензию как опа есть, или после удаления не заключенной в капсулы амилоглюкозидазы, хроматографией на геле (например с помошью геля сефарозы). Прилер 2. Опыт проводят по примеру 1, но используют в качестве раствора, заключаемого в капсулы, 0,05 мл водного буферного раствора (фосфатный буфер 10 ммолей рН 7,2), содержащего 100 мг/мл пенициламина, растворенного в 0,15 мл водного раствора хлористого натрия и используют для образования органической фазы, подвергаемой обработке ультразвуком, 27 мг лецитина и смесь 2,4 мл дибутилового эфира и 0,6 мл хлороформа.Пример 3, Опыт проводят по примеру 1, но используют в качестве раствора, заключаемого в капсулы, 0,1 мл раствора имипрамина концентрации 300 мг/мл в 0,15 М водном растворе хлористого натрия и применяют для образования органической фазы, подвергаемой обработ588905 Формула изобретения 3ке ультразвуком, смесь 25 мг лецитина и 40 мг холестерина и 3 мл дибутилового эфира.Пример 4. Опыт проводят по примеру 1, но используют в качестве раствора, заключаемого в капсулы, 0,05 мл раствора динатрийфосфатбента-метазона с концентрацией 150 мг/мл в 0,15 М водном растворе хлористого натрия и применяют для образования органической фазы, подвергаемой обработке ультразвуком, смесь 15 мг лецитина и 12 мг фосфаттидилэтаноламина,и смесь 2,5 мя дибутилового эфира и 0,5 мл хлороформа.При осуществлении предлагаемого способа становится возможным устранить операции выделения, очистки и повторной подгонки концентрации жидкости, заключаемой в капсулы, позволяя тем самым использовать способ в промьщ 1 ленном масштабе. Способ получения липосом путем обработкиисходного водного раствора ультразвуком в присутствии соединений, имеющих гидрофильную и гидрофобную функциональные группы с последующим выделением целевого продукта, отличаюиийся тем, что, с целью упрощения технологического процесса, обработку ультразвуком осуществляют и прнсутсвии органического гидрофоб ного растворителя с плотностью, ниже воды, а затем к полученной дисперсии добавляют новую порцию воды и трехфазную систему подвергают центрифугированию.Источники информации, принятые во внима ние при экспертизе:1. 3. В 1 ос 11 егп 1 йгу Ьос 1 е 1 у 2/61, 1974, р 1275.Составитель С. Малютина Редактор Л. Емельянова Техред О. Луговая Корректор А. Гриценко Заказ 186 о 20 Тираж 702 Подписное с 1 Н 1 Р 11111 " гг днрсгвенного лс 1 ь, м ; Синс га Министров С,СС Р по делам изобретении и открытий 113035, Москва, Ж 35, Раунскан наб., д. 4/5 Филиал г 1 ПП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4