Способ получения антибиотика

ОП ИСАНИ ЕИЗОБРЕТЕН ИЯ("1) М. )л.С 12 О 9(20 Гооударатоенный комитет Совете Мнннетроо СССР оо делам неооретеннй н открытий(45) Дата опубликования описания 3009,77 ИностранцыУолтер Даниель Селмер, Фрзнк Кристиан Скиаволиио,Джон Бродерик Роутин и Уолтер Патрик Каллен) Авторы изобретени Иностранная фирм(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИК тение относится к об робнол ентов иотит гии.Предлагаемый способ получения антибиотика является новым и в специальной и патентной литературе не описан. Заключается он в том, что Ь штамм Мсгогпоповрога 1 асцвтг 1 в АТСС 21975 выращивают на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с послвдуалцим выделением антибиотического комплекса и разделением его на компоненты известными приемами.ОМикроорганизм, используемый дпя получения антибиотика, .вьщелен иэ образца почв г близ озера Роджера, Коннектикут, США. Этот штамм хранятся в Американском институте коллекции типов культур Рокквилл, Мд под номером АТСС 21975. 15Выращивают М, 1 асовтгв в водной питательной среде, температура 24 - 36 С, условия аэробные, в погруженном состояеии, пря перемешива,аи, Питательная среда содержит источник усваиваемого углерода, такой как сахара, крахмал, глицерин 20 и меласса, источник органического азота - казеин, ферментативная вытяжка казеина, мясная мука, пшеничная кыйковина, мука хлопкового семени, соева ю мука и мука земляного ореха. В качестве стимуляторов роста мог уг быть использованы 25 2диспщляторние дисперсии или дрожжевой экст ракт, а также соли, например, хлорид натрия, ацетат аммония, сульфат аммония, фосфат. натрия и следы минеральных веществ, таких как железо, магний, цинк, кобальт, марганец.Если во время ферментации происходит избыточное вспенивание, то в ферментационную среду добавляют анивспениваюшие агенты, например растительные масла иля снликоны. рН ферментации должно оставаться постоянным, но если про. ииюдит изменение, то к среде добавляют буферный агент (карбонат кальция), Аэрацию среды в резервуарах для выращивания в погруженном состояния поддерживают на уровне 1/2 до 3 обье. мов свободного воздуха на 1 объем бульона в минуту. Во время переноса микроортаниэма в течение его роста поддерживают асептические уо лови я.Ферментацию ведут от 24 ч до 4 дней, Во время процесса ферментации производят биологические анализы бульона с применением ппамма Зтарйу 1 ососсов аогеов.Смесь антибиотиков анализируют тонкослойной хроматографией, Расщепленне компон смеси зависит от содержащихся в ней антибков, Малая активность антибиотика не позволяет обнаружить второстепенные компоненты, большая активность - ведет к эффекту торможения с плохим разделением.Антибиотики, присутствующие в антибиопт. ческой смеси, окрашиваются в различные оттенки оранжевого, желтого и розового цветов.Компоненты смеси извлекают из фермента. ционного бульона при помощи зкстракции растворителями и хроматографического разделения на колонке, Для экстрагирования антибиотиков из осветленного бульона применяют различные ор ганические растворители, Эффективным раствори. телем является метилизобутилкетон. Экстракцию растворителем проводят, используя объем растворителя равный 1/5 объема бульона, из которого извлекают смесь антибиотиков.Анамицины разделяют и изолируют в восста. новленном состоянии, Для их восстановления до. бавляют - 2 г аскорбиновой кислоты на 1 г смеси антибиотиков в бульон перед фильтрацией и пере. мешивают 30 мин при комнатной температуре,Сепарацию и извлечение компонентов смеси антибиотиков осуществляют следующим образом.Осветвленный бульон доводят рН от 4,0 до 4,5 и экстрагируют половиной объема метилизобутил. кетона. Кетон удаляют в вакууме и заменяют промышленным этанолом. Раствор зтанола обез. жиривают повторной экстракцией петролейным эфиром. Ансамицины восстанавливают аскорбиновой кислотой, зтанол удаляют в вакууме, и остаток подвергают хроматографии на колонке из силикагеля с использованием этилацетата с уве. личивающейся концентрацией ацетона в качестве проявляющего растворителя. Фракции с колонки подвергают тонкослойной хроматографии и биоанализу, Активные фракции комбинируют, Основная фракция элюируется и концентрируется.Антибиотические продукты можно получать при помощи М, 1 асизтпз в разбавленной форме, в виде неочищенных концентратов, а также очищенных компонентсв, Все они могут быть использо. вавы для борьбы с микроорганизмами, такими как МцсоЬастег 1 цЬ тцЬегсо оЫз, Орососсов зтгертососсцз, руооепез и Бтарйу 1 ососсоз, включая штаммы, которые устойчивы к другим известным антибиотикам, Их можно применять в качестве дезинфицирующих веществ, для очистки смешанных культур, для медицинской диагностики и биологических исследований.Антибиотик "водят животным и людям через рот или парэнтеральным путем для лечения пневмококковых, стрептококковых, туберкулезных и других инфекций, чувствительных к антибио.тикам, Дозировка при приеме внутрь через рот 0,5-1,0 г в день, при парэнтеральной инъекции 100 в 5 мг в зависимости от типа и остроты инфекции и веса.Он может применяться в виде таблеток, содержащих различные наполнители, например, цитрат натрия, карбонат кальция и вторичный фосфат кальция, вместе с дезинтегрирующими веществами, такими как крахьел, альгиновая кислота, и некоторыми комплексными силикатами и связывающими агентами, например, поливинилпирро.лидоном, сахарозой, желатином и смолой акации.Применяют также смазывающие агенты, такие как стеарат магния, лаурия сульфат нвтрия и тальк,Для введения в рот могут быть использованы 10 водные суспензии или элексиры, в которых основной активный ингредиент комбинируется с различными подслащающими или ароматизирующими агентами, окрашивающим веществом или краси.телем.й Дпя парэнтерального введения изготавливаютрастворы антибиотика в кунжутном масле или масле земляного ореха.П р и м е р 1. Готовят стерильную водную срщу;имеющую следующий состав, г/л:20 Крахмал 20,0Ферментативная вытяжкаказеина 5,0 Дрожжевой экстракт 5,0Декстроза 10,025 Кг НА 4 0,5СаСОз 4,0Клетки иэ М. 1 асцзтйа АТСС 21975переносят в двухлитровые колбы Фернбака, каж.дая из которых содержит 1 л среды, и встряхива.80 ют в течение 3 - 4 дней при 28 С.Около 1% 1 об,/об.) выращенного инокулумапереносят в ферментер с 45000 л стерильной водной среды описанной выше, Поддерживают температуру 30 С, аэрация 1/2 объема воздуха на объем 85 бульона в минуту и перемешивание со скоростью600 об/мин. При вспениЪании добавляют соевое масло для регулирования избьггочного вспенивания. Через 50 - 60 ч 5 - 10% объема этого инояулума переносят в ферментер с 45000 л стерильной.вод ной среды вышеописанного состава, но без мясноймуки, Температуру поддерживают 30 С, аэрация со скоростью 1/2 объема воздуха на 1 объем жидкой среды в 1 мин и перемешивание со скоростью380 об/мин45 Для . регулирования вспенивания добавляютсоевое масло. Сахарозу или декстрозу добавляют через интервалы в 24 ч до уровня - 0,1% вес/объем,Через 90 - 120 ч ферментационный бульонфильтруюти рН доводят до 4,0 - 4,5 в присутствии 60 5 - 10% метилизобутилкетона. Затем бульон экстрагируют 11250 л метилизобутилкетона.Экстракт растворителя концентрируют в вакууме до 1/10 - 1/20 объема, и рН доводят до 5,5 - 6,5 аммиа.ком или раствором Кг НРОаРастворитель (-9 л) удаляют в вакууме изаменяют этанолом, Раствор этанола концентрируют в вакууме до 90 л, которые обезжиривают повторной экстракцией петролейным эфиром, К этанольному раствору добавляют аскорбиновую 60 кислоту (-2 г на 1 г смеси антибиотиков), и раст.575038 Формула изобретения 1 О Составитель С МалютинаТехред А. Демьяном коРРектоР П. Макареаич Редактор И. Хубларова Заказ 2779/699 Тираж 541 Подписное ЦИИИПИ Государственного комнтета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 13035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Финна ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 5вор перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин, Этанольный раствор концентрируют в вакууме при поддержании рН 6 - 7 до жидкого сиропа, который затем берется в хлороформ. Раствор в хлорврорме концентрируют до сиро. па, последний затем хроматографируют на силикагельной колонке и проявляют этилацетатом, со., держащим увеличивающиеся на 5% количества аце. тона. Фракции с колонки подвергают тонкослой 6ной хроматографии и биоанализу и соответственнокомбинируют. Способ получения антибиотика, о т л и ч а ю. щи й си тем, что штамм Мсгопюпоарога 1 асцаМа АТСС 21975 выращивают на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последучицим выделением антибиотиче ского комплекса и разделением его на компоненты иэ. вестными приемами,