Способ получения антибиотика

(31) 325264 2) 22,01.73 асударстеенныи ивмитетСаавта Ииииетраа СССРпа делам изобретенийи етирытий(45) Да бликования описан 20.07.7 72) Авторы изобретения ИностранцыРоберт Л, Хамилл и Вильям Макс Ста Иностранная фирма(54) СПОСОБ ПОЛУЧБНИЯ АНТИБИОТИКА 1 ние относится к микробиологичеАктивныи комп соединение, не расп ниже 220 С, Элема 44,98, водород 6,15, остальное 4,14, Комп вес около 1500,опред рическим методом.Компонент А аб товом районе спектр абсорбш 1 и в всде п уступ) и 273 тм (Хлоте изменения не пр циальной литер нтибиотика т наи было,Предложенный способполучения антибиотика заключается в том, что культуру Ас 6 порапее цтаЬепез 1 з ЯНВ 1 5614 выращивают на среде, содержащей источники углерода, азота и неорганические соли, с последующим выделением и очисткой целевого продукта и разделением на активные компоненты известными приемами.Предлагаемый антибиотик включает два пептидных активных компонента А и В. Эти компоненты структурно связаны друг с другом и прояв. ляют химические, физические и спектральные свойства, аналогичные дпя пептидов, Компоненты сопутствуют ферментации и получаются в виде смеси. Их отделяют друг от друга и изолируют, как индивидуальные соединения,Смесь активных компонентов А и В предсивляет собой белую пудру, растворимую в воде и низших спиртах, ио нерастворимую в большинстве органических растворителей. Активный компонент В - белое15соединение не имеющее отчеттщвой точния, но обугливающееся при теьатературЭлементарный анаи 1 з%: углерод 49,966,98, азот 9,90, кислород 23,86, остальМолекулярный вес компонента В -2800в метаноле осмометрическим методом,Компонент В абсорбируется в ультсвом районе спектра и показьвает абсормаксимуьп 1 в воде при Хмакс 220 тмуступ) и 273 тм (Х 3,200): в основкислоте изменения не происходит. аморфное кч нлавле. е -200 С. водород ное 4,66. определентрафиоле бционные (Е 9,200; ромышленности,В доступной патентной и спетуре описания способов полученияспользованием указанной культур онент А - белое аморфное лавляемое при температурах парный анализ, %: углерод азот 10,28, кислород 26,37, онент А имеет молекулярный еленньщ в метаноле осмометсообируется в у.ьтрафиолеа н псказьиает максимумы ри Хмакс. 220 тм (Х 9,500;700) в осп;:ванин или кис оисходит, 509246Смертельных. случаев не было при оральном введе- е зо 35 45 50 55 Электрометрическое титрование показываетпостоянный расход основания, что является отличи.тельной особенностью циклических пептидов,,.Компоненты А и В и их смеси значительнорастворимы в воде и в таких низших, спиртах-,.как;бутанол и метанол. Они нерастворимы в большинстве органических растворителей таких как,например, диэтиловый эфир.Антибиотик и его активные компоненты пред.отвращают рост микроорганизмов, патогеничных кживотным и растениям, Кроме того,антибиотик иего компоненты рбладают пвотивопаразитным иускоряющим рост действием,Антибиотическая смесь и компоненты особеннодейственны против патогенических грамм-положительных бактерий, как вне, так и в организме, имогут использоваться для лечения и контроля забо.леваний, вызываемых этими бактериями.. Активный компонент В в минимальных количествах присутствует в антибиотической. смеси.Активность компонентов А и В вне организмасовершенно одинакова. Таким образом, разделениеэтих двух компонентов, используемых при обработке и контроле болезнетворных организмов илив качестве ускорителей роста, не является существенным.Острота токсичности антибиотика, определенная при внутрибрюшинном введении мышам ивыраженная как И о составляет 1370.мг/кг,дии мьппам 1250 мг/кг антибиотика.Противомикробное действие антибиотика ворганизме наблюдают при его введении мышам илипарэнтерально или орально,Полезным свойством антибиотика является егспособность улучшать ростовую характеристикуживотных, При добавлении к пище растущих цыплят 45,4 г на 1 т корма средний весовой приростпосле 10 дней составляет 159,9 г, по сравнению сосредним весовым приростом 146,1 г для контроль.ной группы, Способность антибиотика стимулиро.вать весовой прирост делает его особенно полезнымдня увеличения продукции животноводства, Прииспользовании его в качестве ускоряющего ростагента можно применять соответствующие концентрации антибиотика в нормальном пищевом рационеживотных. Антибиотик эффективен как росто.ускоряющий агент при введении животным в дозахот 10 до 1,0 г на 1 т пищевого рациона,Антибиотик является противопаразитным агентом, в особенности эффективен против рецидивнойлихорадки, вызываемой спирохетой ВоггеНа иочт,при парэнтеральном введении в примерной дози.ровке от 10 до 500 мг/кг.Антибиотик может быль использован как по.верхностный дезинфектант, Растворы, содержащиедва процента антибиотика, являются эффективны.ми для целей дезинфекции. Такие растворы, содер. жащие также детергент или другой очищающий агент, являются полезными для дезинфекции стеклянных изделий, зубных и хирургических инструментов, а также стен, полов и столов в помещениях, где важно поддерживать стерильные условия, т.е. в госпиталях или помещениях для приготовления нитци.Новый антибиотик получают путем выращивания производящего штамма из Асбпораоез организма в условиях азробного погружения в соот.ветствующей культуральной среде, Антибиотики извлекают с помощью различных обычно исноль.зуемых и известных методов выделения и очистки.Микроорганизмом, пригодным, для приготовления антибиотика, является разновидность класса Аст 1 пор 1 апез, семейства Аст порапасеае, порядка Астпощусета евПриюдйая для дроизводства ащибиотика 1 сультура Асбпорапез хранится в коллекции культур Северного отделения прикладного исследования и развития Министерства сельского хозяйства США, Пиория, Иллинойс 61604, известна под номером ИВВ 1. 5614.Культура, производящая антибиотик, классифицирована как новый штамм Асьпорапез Отапепез з Соцсп.5 Морфоцогия.Вегетативный мицелий, Гифа на синтетическойи нолусинтетической агаровой соеде является длинной, разветвленной, разделенной перегородкой и имеет от 0,2.до.4,2 мкм в диаметре.;:На поверхности агара мицелий образует компактный, слегка поднятый и иногда похожий на кожу рост. Воздушные тифы не образуются на любой среде. Вертикальные тифы в изобилии находятся ниже поверхности агара. Каждая вертикальная гифа берет начало из горизонтального слоя гиф, который в изобилии находится более глубоко в агаре и заканчивается на поверхности агара с образованием спорангия,Спорангий, В изобилии образуется на агареЧапека. Появляется после семи дней инкубации при 4 О 22 - 25 С, По мере роста вся поверхность колониипокрывается плотной спорангиальной подстилкой.Спорангий рождается разрозненно на очень коротких спорангиоспорах(концевая часть вертикальных гиф над агаровой поверхностью). Иногда спорангийоспоровые ветви дают начало вторичному или, редко, третичному спорангию, Спорангий обычно имеет сферическую или субсферическую форму и может быть до 8 - 10 мкм. Он содержит -35 - 50 спорангиоспор, которые расположены в одном или более выпуклых кольцах в спорангии, При зрелости спорангиоспоры имеют диаметр -1,0 мкм, Спорангиальное раскрытие всегда появляется при общем измельчении спорашиальной стенки. Процесс высвобождения спор обычно начинается спустя 10 или 15 мин после помещения спорангия в воду.Обычно споры не становятся подвижными сразу, но становятся активно подвижными при действии пучка полярной флагеллы в течение -5 мин.На агаровом растворе Чапека. Хороший рост, о точечный.прививочный материал в течение 4 недельдает колонию в диаметре около 1 см. Воздушныегифы не наблюдаются. Колония обычно имеет не.значительное центральное поднятие. Цвет колониивначале ярко - оранжевьй и становится тускло - оранжевым, когда образуется спорангий ипокрывает мицелий.Пептоновый агар Чапека. Прекрасный рост;точечньй и прививочный материал в течение 4недель дает колонию диаметром около 0,5 см. Воз.душные гифы не наблюдаются. Колония обычноровная, рассеянная и слегка слизистая. Цвет колониитускло - коричневатьй, оранжевьй. Спорангий непроизводится.Апо - Неоввеп агар. Прекрасньй рост; точечньй прививочный материал в течение 4 недель даетколонию диаметром около 0,5 см, Воздушныегифы не наблюдаются, Колония является горопо.добной, имеющей острую вершину. в центре сострыми гребнями, выдающимися к краям коло.нии. Цвет колонии от ярко - оранжевого до желто-оранжевого. Спорангий образуется в большомчисле в старой части колонии, но не до такогоразмера, как при образовании на растворе агара,Химический состав системы клетка - стенка,Клетка - стеиочный химический состав Асбпор 1 апев отапепейв МЯВОМ. 5614 подобен штаммамАсб пор апев цтапепев 1 в,Асбпорапев о 1 айелевв ИВЯ 1.5614 может растив культуральной.среце с получением антибиотиков:Культуральная среда может быть любой из ряда известных, однако для экономии продукции, максимального выхода и легкости выделения антибиотиков предпочтительной является определеннаякультуральиая среда. Одним из предпочтительньжисточников углеводов является патока, источниковазота - . соевая мука.В культуральную среду должны быть введеныпитательные неорганические соли, которые представляют собой обьтчнь 1 е соли, способные приноситьнатрий, калий, аммоний, кальцв, фосфат, хлорид,сульфат, ацетат и карбонат. Кроме того, вводяттакие источники ростовых факторов, как барду идрожжевые экстракты. В культуральную среду для .выращивания Аст 1 порапев вр, у включают и сопутствующие элементы,Начальное значение рН культуральной средыможет изменяться. Однако перед прививкой с организмом доводят рН культуральной среды до 6,8и 7,5 в зависимости от конкретной используемойсреды. Конечное значение рН определяется начальным значением рН буферных веществ, присутст. вующих в среде, и периодом времени, в течениекоторого организм может расти.Для производства значительных количествантибиотика используют затопленную аэробнуюферментацию в резервуарах. Малые количестваантибиотика получают из культуры во встряхи.. ваемой склянке, Вегетативную прививку осущест-,вляют путем прививания малого объема культу.ральной среды со споровой формой или фрагмен 51 О 15 20 25 30 зь 40 45 50 55 60 тами мицелия организма для получения свежей, активно растущей культуры организма, Затем веге. тативную прививку переносят в больший резервуар. Используемая для выращивания вегетативной прививки среда может быть такой же, как и исполь. зуемая для больших ферментаций, но может быть использована и друтаяАнтибиотик, производящий организм, может выращиваться при 20 и 35 С, оптимальная температура около 30 С,Стерильньй воздух продувают через культу. ральную среду. Для производительного вырашива. ния организма и антибиотиков объем используемого в резервуаре воздуха составляет более 0,1 объема воздуха в минуту на объем культуральной среды. Оптимальньй рост происходит при объеме используемого воздуха между 0,6 и 1,0 объемами воздуха в 1 мин на объем культуральной среды,Производство антибиотиков контролируется в течение ферментации путем исследования образцов бульона на антибиотическую активность против организмов, известных своей чувствительностью к антибиотикам. Одним из испытательных организмов является Багсеаотеа АТСС 9341,Максимум производства антибиотической активности достигается в период от 20 до 94 час.Антибиотическая активность во время ферментирования производящего организма имеет место в антибиотическом бульоне, В соответствии с этим используемые в производстве антибиотиков методы вьщеления выбирают для обеспечения максимального извлечения антибиотиков из бульона, Поэтому, например, мицелий и нерастворимые твердые вещества удаляют из ферментационного бульона обычными способами, (фильтрацией), а антибиотики удаляют из отфильтрованного бульона экстракцией или абсорбцией,Штамм Астпорапев МВВ 5614 производит антибиотический компонент А, как преобладающий компонент, Компонент А составляет примерно от 95 до 98% общей извлеченной антибиотической активноспг. Компонент В составляет остаток антибиотической активности.Низшие спирты, такие как бутанол и центанол, являются подходящими растворителями длямэкстрагирования профильтрованного бульона, Дальнейшая очистка антибиотика включает допол. нительные операции экстракции и абсорбции. Для этого с успехом могут быть использованы такие абсорбтивные материалы, как Яерпадех 6 = 25 или 6 = 50 или алюминий.Активные компоненты А и В отделяют друг от друга и выделяют в качестве индивидуальных соединений с помощью известных методов -противо- точным распределением, препаративной тонкослойной хроматографией или колонной хроматографией, Предствителями аде орбентов для колонной хроматографии служат: алюминий, элюирующий фактор В с метанолом и А с 2 о-ным аммонием в метаноле; ДЕАЕ - целлюлоза при градиентномУклон прививают с Аст 1 порапеа аТайепеяа ИЯЯ 1 5614 и выращивают при 30 С от 10 до 14 дней, Полученный в мицелии пигмент изменяется от оранжевого до оранжево - коричневого, Культура не нормально опорилировала на этой среде; поэтому необходимо вымочить мицелиальный мат ровн)й заостренной прививочной иглой, чтобы увеличить число потещиальвих центров роста. Размоченную созревшую культуру покрывают стерильиой водой 35 и осторожно скоблят стерильным прутом для полумиия мицелиальной суспензии, Эту суспенэию .сохраняют лиофилизацией. 1/6 часть приготовленной Уклонной культуры используют для прививки 50 мл вегетативной среды следующего состава (г):,щОвсишка (предварительносваренная) 20,0Триптон 5,0Сухие дрожжи 2,5Деионизированная вода 1(л).Начальное значение рН вегетативной среды пркблизительно 7,2; после 72 час рН составляет -б,б - 7,0. Вегетативную среду прививают. и выра. щивают в склянке (250 мй).при 30 С в течение 72 час на ротационном встряхивателе при 250 об(мин, 50 Конечные твердые вещества составляют 20 - 30%.Б.Ферментация в резервуаре,Вегетативную среду (1,25 л), приготовленную как описано выше, используют для прививки 25 л стерильной продуктивной среды следующего соста ва (г): СахарозаСоевьш цветПатока 10,0 10,0 300 элюированин с 0,001 М до 0,2 М буферным раствором уксуснокислого натрия, рН 5,6; катионообменная смола (ХЕ - 64 в водородном цикле), элюирование с 0,05 М цитратным буферным раство.ром с градиентным изменением рН от 5,2 до 5,8.Противоточное распределение является предпочтительным методом разделения, Хорошие резуль.таты при этом методе достигаются, если одна фаза . является полярным, несмешивающимся с водой растворителем, или растворной смесью, и другая фаза является буферным раствором, имеющим рН в области -5,0 - 8,5. Оптимальнью результаты дости гаются, когда одна фаза является такой растворной системой как, например, мещлизобутилке тон: бутанол или зтилацетат: этанол, а другая фаза является буферным раствором, имеющим рН в области -6,8 - 7,0.П ри ме р 1.А. Ферментирование антибиотика во встряхи.ваемой склянке.20Культуру Асбпорапез цтаЬепеыя КЯЯ 5614 приготавливают и помещают на агарный уклон,имеющий следующгй состав: овсянка (предвари.тельно сваренная) 65 г, агар 20 г, деионизированная вода 1 л.25Энзиматический гидролизат казеинаК 2 НРО 4МЯВО 4Оочч Согпп 9 ап 6 Фсав(антивспениватель)Минеральная смесь ЧапекаВодопроводная вода 4,0 1,0 1,0 0,2 5,0 (мл)25 (л),После стерилизации в автоклаве при 120 оС в течение 30 мин рН среды равно 7,2. Привитую продуктивную среду помещают для ферментироваиия в течение 5 дней при 30 С в ЗО.литровый ферментационный резервуар. Ферментационную среду про. дувают стерильным воздухом со скоростью 1 объем воздуха на объем культуральной среды в мИнуту и перемешивают в обычной мешалке при 400 об/мин. П р и м е р 2. Выделение активных компонентов. Активные компоненты А и В разделяют противоточным распределением, используя 15 раздели. тельных воронок (500 мл) с 250 мл каждой фазы и движущуюся нижнюю фазу, Верхней фазой является метилиэобутилкетон:1 - бутаиол (3:2), нижней,1 М буферный раствор фосфата натрия с рН 6,8., Компонент А перемещается с нижней фазой, компо. непт В остается в верхней фазе первой воронки. Выпаривание под вакуумом дает 0,1 г компонента В. Коьшонент А извлекают из буферной фазы экстракцией с 1 - бутанолом, Бутанольный экстракт выпаривают досуха под вакуумом. Полученный таким образом остаток растворяют в метаноле и вновь используют эфир для осаждения 2,9 г компонента А,Ферментационный бульон (-25 л), полученный. по примеру 1, профильтровывают с вспомогатель. ным фильтровальным порошком (НуПо Борег - се 1 диатомовая земля), рН фильтрата бульона доводят до 6,5 при разбавлении соляной кислотой, а затем фильтрат дважды экстрагируют с бутанолом, Бута. нольный экстракт концентрируют под вакуумом с получением масла, Масло растворяют в буферном . растворе фосфата натрия (0,1 М, рН 7,0), и буфер. ный раствор трижды экстрагируют с бутанолом, Бутанольный экстракт выпаривают под вакуумом досуха Остаток растворяют в метаноле; для осаж. дения антибиотической смеси добавляют эфир. Оса. док отделяют центрифугированием и высушивают в вакууме с получением рыжевато - коричневой пудры (выход из исходного фильтрата примерно 50 - .65%), Этот остаток дополнительно очищают и хроматографируют над Яерпадех 0 - 25 в воде. После хроматографической очистки активный материал вновь осаждают из метанола с использованием эфира, выделяют, как указано выше, и получают 3 г антибиотической смеси.509246 С гель С МалютинаТеаред Н, Андрейчук Редактор Н, Спиридонова Корректор С Шекмар Тираж 574 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Заказ 955/504 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Формула изобретенияСпособ получения антибиотике, отличающий с я тем, что культуру Аст 1 пор 1 апеа отцепиа ЙЯЯ 1.5614 выращивают. на сиада; аавужащей источники углерода, азота и неорганические соли, с после.дующим выделением и очисткой целевого продуктаи разделением на активные компоненты нзвестными нрие мами.