Способ получения азотистых оснований

пщ 570610 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ К АВТОРСКОМУ СВКДЕТЕЛЬСТВУСова Советских Социалистических республик(22) Заявлено 04.06.75 (21) 2140382/04 51) М. Кл.з С 07 Р 471/00 соединением заявк Государственный комитет Совета Министров СССР по делам изобретенийи открытий 23) Приоритет публиковано 30,08.77. 53) УДК 547.857,0(088,8) ллетень К ата опубликования описания 16.09.7(71) Заявитель Г, Д. Бердышев, Н, А. Луценко и Т, Б. Дьяч Киевский ордена Ленина государственный ун им. Т, Г, Шевченко) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЗОТИСТЫХ ОСНОВАНИ Изобретение относится к получению биологически активных веществ, которые могут найти применение в биологии и медицине в качестве физиологически активных веществ, а также в химической промышленности как сырье для синтеза реактивов.Известен способ получения азотистых оснований путем кислотного гидролиза нуклеиновых кислот, содержащихся в природном нуклеотидном сырье. Азотистые основания из полученной смеси гидролизата нуклеиновых кислот выделяют методом ионообменной хроматографии 1.Недостатком известного способа получения азотистых оснований из полимерных нуклеиновых кислот путем кислотного гидролиза с последующим их разделением на ионообменных колонках является трудоемкость получения целевого продукта и использование для этого дорогостоящего сырья - полимерных нуклеиновых кислот, а сам процесс получения сопровождается использованием дорогостоящих реактивов и оборудования, что в конечном итоге обуславливает дороговизну получения азотистых оснований.Цель предлагаемого изобретения - расширение сырьевой базы за счет утилизации промышленных отходов.Согласно изобретению поставленная цель достигается тем, что азотистые основания получают путем кислотного гидролиза отходов производства протаминсульфата из молок рыб с последующим разделением полученной смеси азотистых оснований обычным методом 5 ионообменной хроматографии,В процессе получения протаминсульфата измолок рыб исходного сырья, согласно данному изобретению, молоки рыб подвергают обезжириванию, удалению рибонуклеиновой кис О лоты, а также пигментов и в конечном итогепротаминов, В таком случае после горячей кислотной экстракции (3 - 5%-ной серной кислотой) протаминов из молок осетровых, сельдевых, лососевых и других рыб образуются бросовые отходы производства протаминсульфата.Данные о химическом составе отходов производства протаминсульфата из молок рыб приведены в табл. 1. Общая влажность таких 20 отходов составляет в среднем 36,5%. В целях утилизации отходов производствапротаминсульфата из молок рыб для получения азотистых оснований их хранят в тща тельно перемешанном виде в темных стеклянных банках в пределах температурного диапазона от О до +4 С, или же в высушенном виде (с содержанием влаги 2% в темных стеклянных банках с притертыми пробками при обычае ной температуре),Таблица 1 Отходы производства протаминсульфата из молок дальневосточных лососей Зола 2,518,05 4,28 4,8572 30 11 48 11 0,85 1,16 0,41 5,92 Нерастворившнйся осадокНативная ДНКПолисахариды Азотистые основания описываемым способом получают следующим образом.Г 1 р и м е р 1, 500 мг отходов протаминсульфата, высушенных до постоянного веса при 24 С и растертых в порошок, помещают в стеклянную ампулу с последующим добавлением по каплям до полного смачивания 72% НС 04, Далее из ампулы откачивают воздух. Ампулу затем запаивают и помещают в кипящую водяную баню для гидролиза ДНК отходов до азотистых оснований в течение 1 час. Кислотный гидролиз можно осуществлять одновременно в нескольких ампулах.После осторожного вскрытия ампулы гидролизат, полученный вышеописанным способом, разбавляют в 20 раз элюирующим буфером 0,2 М ХН 4 С 1 (рН 10,6), предварительно определив объем гидролизата, например эталонной ампулой.Разбавленный в 20 раз элюирующим буфером гидролизат, содержащий азотистые основания, для отделения механических примесей и осадка центрифугируют в течение 8 - 15 мин при 2000 д. Супернатант, содержащий смесь азотистых оснований в 0,2 М аммиачном буфере (рН 10,6), наносят на колонку 15 К 0,8 см с Дауэкс 1 х,4 (300 меш, хлоридная форма).Смолу предварительно промывают поочередно кислотой и щелочью с целью освобождения ее от загрязнений, в особенности от веществ, поглощающих в ультрафиолетовом свете. Для этого смолу трижды промывают водой для удаления мелких частиц, затем трижды промывают 1 н. раствором аммиака, водой,40 45 50 55 60 65 Химический состав отходов производства протаминсульфата из молок лососевых рыб,высушенных до постоянного весаПрирода исследуемого сырья, о; Общий азотОбщий фосфорЖиры и липидыОбщая сумма кислоторастворимых продуктов деградацииДНКАзотистые основания, моль. Оо:тиминцитозннаденингуанннРНК 5 10 15 20 25 30229 228 233 238 Фракции азотистых оснований объединяют, упаривают и идентифицируют. Таким образом, получают четыре фракции азотистых оснований с молекулярным соотношением цитозин - тимин в гуанин в ад 10,5: 3,5: 7: 45. Сухой остаток, полученный в результате упаривания фракций, растворяют в небольшом количестве воды и наносят на бумагу в виде небольшого пятна, Параллельно испытуемым фракциям оснований наносят четыре свидетеля: аденин, гуанин, цитозин и тимин,Для бумажной хроматографии используют следующие системы растворителей: абсолютный метанол + концентрированная соляная кислота + вода (70: 20: 5 Р/); изопропиловый спирт + вода + концентрированный аммиак (85: 15: 1,5 /Ь) . Положение пятна, испытуемых фракций оснований и свидетелей (14) выпадает,В табл. 2 приведен выход целевого продукта из предлагаемого сырья,В конечном итоге из 50 мг высушенных до постоянного веса при 24 С отходов производства протаминсульфата из молок рыб получают цитозина 6 мг, тимина 10 мг, гуанина 6 мг, аденина 15 мг. 41 н. раствором уксусной кислоты и водой до нейтральной рН промывной воды.11 осле последней промывки водой, не содержащей СО смола готова к употреблению. Затем смолу переводят в хлоридную форму путем суспендирования ее в 1 н. НС. Заполнение колонки смолой осуществляют в растворе 2 и. соляной кислоты под давлением гидростатического столба жидкости. Запол. ненную колонку промывают (уравновешивают) тем же раствором, который применяют для элюирования (0,2 М ХН,ОН - 0,2 М ХН 4 С 1, рН 10,6) до тех пор, пока рН оттекающего раствора не станет равной рН подаваемого раствора.Одни и те же колонки используют многократно после соответствующей регенерации.Элюацию оснований осуществляют указанным выше 0,2 М аммиачным раствором. Скорость элюации 0,5 мл/мин. Фракции собирают на автоматическом коллекторе.Процесс разделения азотистых оснований контролируют при помощи определения оптической плотности каждой фракции на спектрофотометре СФ, Идентификацию выходящих пиков азотистых оснований осуществляют по кривым поглощения в ультрафиолете с помощью бумажной хроматографии.Полученные азотистые основания имеют следующие максимумы и минимумы оптического поглощения в ультрафиолете (на спектрофотометре СФ):570010 Таблица 2 также путем измерения их ультрафиолетового спектра поглощения. Убедившись в высоком качестве полученных азотистых оснований, их подвергают ионообменной хроматографии описанным выше способом.Выход азотистых оснований почти одинаковый с хлорной кислотой, т. е. 7% от веса сухих отходов.Недостатком использования муравьиной10 кислоты для гидролиза ДНК отходов является неполное сжигание дезоксирибозы и некоторых других компонентов, что приводит к появлению углеобразного остатка, мешающегоанализу. Кроме того, в муравьиной кислоте15 невозможно проводить прямоточное спектросротометрирование азотистых оснований, какэто удобно делать при использовании хлорнойкислоты. Для муравьиной кислоты болеесложная процедура упаривания гидролизата,20 требующая создания атмосферы азота.Гидролиз отходов можно проводить и некоторыми другими кислотами (серной, соляной),но использование пх имеет ряд существенныхнедостатков по сравнению с хлорной кислотой25 разрушение отдельных оснований, неполныйгидролиз материала и т. д.),1 редложенный способ получения азотистыхоснований характеризуегся простотой, удешевлением себестоимости целевого продукта иЗЭ позволяет расширить сырьевую базу и болееполно и рационально использовать ценноесырье - молоки рыб. Количес;ь:нный выход азотистых оснований, оа от веса сухих отходов производства протаминсульфатаиз молок лососевых рыб Количественный выход азотистых оснований, мг на 100 г сухих отходов производства протаминсульфата из молоклососевых рыб Азотистое о, цыган;е ЦитозинТимин 1,2 2,0 1,2 3,0 1200 2000 1200 3000 Гуанин Алонии Азотчс 1 ыс основания можно также разделить вышеописанным способом и на ионообменпой смоле ЭД 3-101.Азотистые основания из предложенного сырья можно получить также путем кислотного гидролиза и другими кислотами, например муравьиной,11 р и м е р 2. Навеску отходов производства протаминсульфата из молок, высушенных до постоянного веса при 24 С и растертых в порошок, помещают в прочную стеклянную ампулу и к ней добавляют 88/а муравьиную кислоту из расчета на 50 г отходов 50 мл кислоты. Ампулу запаивают с откачиванием воздуха и нагревают при 1 ОС 30 мин. В этих условиях происходит полный гидролиз ДНК до азотистых оснований, дезоксирибозы и остатков сросфорной кислоты, но одновременно муравьиная кислота разлагается с образованием СО, вследствие чего происходит повышение давления внутри ампулы.После окончания гидролиза ампулу охлаждают, вскрывают острым кончиком пламени горелки, после чего давление в ампуле становится равным атмосферному. Далее в токе азота при температуре 60 - 70 С гидролизат в ампуле упаривают, азотистые основания при перемешивании растворяют в 25 мл НС 1, отцентрифуговывают от углеобразного осадка. Супернатант вместе с азотистыми основаними собирают, упаривают при температуре 80 - 90 С в атмосфере воздуха. Далее азотистые основания идентифицируют хроматографией на бумаге совместно со свидетелями, а Ф о р мула изобретения 351. Способ получения азотистых основа пйпутем кислотного гидролиза сырья, содержащего нуклеиновые кислоты, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью утилизации промышлеп ных отходов, кислотному гидролизу подвергают отходы производства протаминсульфатаиз молок рыб.2, Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что кислотный гидролиз осуществляют кон центрированной хлорной кислотой. Источники информации, принятые во внимание при экспертизеСоставитель В. ЖестковРедактор Л. Герасимова Техред Л. Гладкова Корректор Т. Добровольская Заказ 2080/2 Изд. Ма 721 Тираж 5 бЗ НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 13035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5" Количественный выход азотистых оснований из отходов производства про 1 аминсульфата из молок лососевых рыб, предварительно доведенных до постоянного веса при 21 С, на ионообменнзй смоле Даузкс 14 в хлориднон форме. 50 1. Кочетков Н. К., Торгов И. В Ботвинник М. М. Химия природных соединений, М., 1961.2. Ке 1 епеп Рече Р., Редепз Европ Т, КарЫсо 1 цгпп сггогпа 1 озгар 11 у Ьазез оп Ес 1 еоа се 1- 55 1 ц 1 оза а гоогп 1 егпрега 1 цге апс 1 е 1 еа 1 ед ргеззцге, 1 ча 1 цге, 1966, 211, Мо 5051, с. 857 в 8.