Способ получения антибиотика 3(n-4-аминобутил) аминопропиламиноблеомицина (блеомицина а5)

Сои СааетснвйСйищваактическихРесйублин лнительйый к(23) Приоритет- (31) 10774/68 (43) Опубликовано 25,0 (45) Дата опубликоваии Гасудеретееииый иаиит Сееете Миииетрев СИ аа делен изееретеиийи еткрытий(088,8) ностр андыКендзи Маеда, Томохисв анахитабууоси Симвдв и Хидео ЧимураЯпония)71) Заяви Кагаку Кенкю Кай" СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНГИБИОТИКА 3"( М 4-АМИНОБУТИЛ)-АминопропилАмино-ииюмицинА (Блеомицинл А 5) ПрнЯ нз 643,5 порошотвара к0 1 вториФата цинка м е р 1. К среде, состоящей(впросяного желе; 0,5 глюкозы, ка соевых бобов, 0,75 крепкого укурузы, 0,3 хлористого натрия,чного фосфата калия, О;05 суль- , 0,01 сульфата меди, 0,2 ничя н 0,01 Тойо М 1 (торговое.ние поверхностно активного аген 3 рвча натр наименоваИзобретение относится к фврмвцевтичес кой промышленности.Известен способ полччення антибиотика блеомицина А путем культивирования про дуцента ЗЬВф 4 оеиуаб ИМмьйВЬ на пи твтельной среде, содержащей источники азота, углерода. минеральных солей, целевой продукт выделяют известными приемамиОднако таким способом получали незна-чительные количества антибиотика в смеси с другими блеомицинамн.С целью повышения выхода целевого. продукта, выращивание осуществляют в присутствии 3-( Й -4-аминобутил)-аминопропилвмина илн Щ,й -бис (3-амннопропил)-1,4- диаминобутвна,та), прибавляют М, Ж -бис-(3-амннопрогнл)- "14-дивминобутан в количестве 0,2 мг/мл устанавливая рН среды 6 5. Каждые 100 мл обработанной среды отдельно загружают в колбы Сакагущи и затем стернлизуют.Затем В среду инокулнруют ЯМЬЬщуюьСИ(4(ЖВЕ (ОС Ж 15003) и ул - тивнруют арн 27 С и течение 192 час прн. перемеижввннн со скоростью 130 об/мнн.19 После этого культуральную жидкость собирают и фильтруют, получая 1,1 л фильтратв (эффективность 150 мг/мл, общая эффективность 165,0 мг), Этот культуральный фильтрат пропускают через колонку, В заполненную 70 мл Амберлитв 19 С607 и концентрируют до:уХа. Полученныйостаток растворяют в 2 мл 80%-ного водного метанола и загружают в колонку, заполненную 10 мл нейтральной окиси алюми-ния, затем элюируют 80% ным водным метанолом, После чего собирают фракции, содержащие блеомицин, концентрируют их до.суха и получают 62 мг сопянокислого блеомицина (эффективность 1200 мкг/мг, об- .щая эффективность 74,4 мг). Выход изкультурного фильтрата 45%.Полученный нродукт разделяют на дт 1дельные блеОмициновые компоненты воднымраствором формиата аммония на СЯ- Сефадексе в колонке, определяя, что он со,держит 90,8% блеомицнна АЭтот метод разделениясйтоит в следующем. 50 мг указанного продукта растворяют.в 0,5 мл воды и загружают в колонку, заполненную 5 мл Сефадекса С,затем элюируют дистиллированной водой.Полученную голубовато-зеленую фракцию,содержащую блеомиции, седелякл, суспендируют в 0,02 Н водном растворе хлористого аммония, вносят в колонку, заполненную 5 мл СМ- Сефадекса, и эллюируют0,1 М водным раствором хлористого аммония.После этого полученную фракцию, содержащую желаемое вещество. пропускают чераз копонку, заполненную 2 мл активированного угля,.для адсорбцин желаемого вещества, которое элюируют смесью 1:1 ацетона и 0,02 Н соляной кислоты. Затемэлюат концентрируют досуха, получая 15 мгблеомицина А (эффективность 2540 мкг/мгобщая эффективность 38,1 мг), Выход про 5дукта составляет 78,24%,10 мг полученного вещества растворяют в 1 мг метанола, и в раствор в течение 10 мин пропускают газообразный сероводород. Затем раствор фильтруют, фильтрат концентрируют досуха, получая 7 мгсвободного от меди солянокислого блеоми-цина А (эффективность 2500 мкг/мг,5общая эффективность 17,5 мг). Освобожденный от меди продукт гидролизуют 6 Нводной соляной кислотой, подверГают электрофорезу на бумаге и определяют спермидин.П р и м е р 2, К среде, содержащей,(торговое наименование поверхностно активного агента), прибавляют-( й -4 аминобутил-аминопропиламин в количестве 0,4 мг/мл, установив рН среды 6,5, 12 лобработанной среды загружают в стеклянный ферментатор емкостью 20 л и стерилизуют.В эту среду ннокулируют 800 мл культуральной жидкости ИМЬ 1 ЖффЬ И 4 Й -ЯЬМ (АТСС15003), которую в течение 48 час встряхивают для культивирования в среде того же состава, что приве ден выше, и культивируют в течение 163очас при 27 С при перемешиваиии со скоростью 350-370 об/мо 1, вводя через минуту воздух в объеме, равному объему среды, 7 0 л культуральной жидкости фильтруют, фильтрат (эффективность 122,2 мкг/мл,общая эффективность 611,0 мг) экстрагируют, очищают по методике примера 1 иполучают 180 мг солянокислого блеомицина (эффективность 1200,0 мкг/мг; общаяэффективность 216 мг). Выход нзкульту, рального фильтрата составляет 35,4%.Полученный продукт растворяют в 10 млдистиллированной воды, раствор загружаютв колонку емкостью 50 мл с СМ- Сефадексом, суспендированным в 0,02 Н водномРастворе 1 формиата аммония для полученияфракции, содержащей блеомицин А . Эту5фракцию пропускают через колонку, заполненную 10 мл активированного угля, н ад- ЗО сорбируют ее, промывают водой, элюируютсмесью 1;1 (но объему) ацетона 0,02 Нводной соляной кислоты, Затем полученнуюактивную фракцию элюата концентрируютдосуха, получая 44,7 мг блеомицина А в еб5виде солянокислой соли (эффективность2543 мкг/мг, общая эффективность 113 7мг), Выход солянокислой соли составляет52 6%. Это вещество гидролизуют 6 Н соляной кислотой, обрабатывают 10%-ным раствором едкого натра и проводят газовую хроматографию; используя колонку, заполненную Флуропакк 80 (торговое наименование), покрытый Силиконом 8 Г 96 (торговое наименование), Так определяют пик спермидина.30 мг полученного солянокислого блеомицина А (эффективность 2543 мкг/мг, общая эффективность 76,28 мг) растворяют в 50 мл метанола, в полученный раствор в течение 30 мин вводят газообразный сероводород для получения осадка сульфида меди. Этот осадок отфильтровывают и промывают метанолом. Потом объединяют промывные жидкости ь фильрат и смесь упаривают досуха, получая 25 мг свободного от меди блеомицина А в виде соляиокис:)лой соли (эффективность 2;00 мкг/мг, об