Способ выявления сиаловых кислот в гистологических средах

(5 ) 5 6 01 г( 3 3 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) АТЕНТНОЕ БРЕТЕ ИСАНИЕ ть использования: биология и а именно гистология, цитология, ия, патоморфология, Сущность ия; проводят предварительное е терминальных остатков галакцетил-О-галактозамина путем инрезов с нативными лектинами сои, затем обрабатывают срезы бузины черной, коньюгированным азой хрена, а затем выявляют акероксидазы в системе диаминоН 202 и идентифицируют место ии сиаловых кислот по наличию окрашенного продукта реакции,ткани готовят срезы толщиной 5 - 7 мкм. После депарафинации активность зндогенной пероксидазы ингибируют при инкубации срезов в метаноле, содержащем 0,3% Н 202, и через спирты нисходящей концентрации доводят до забуференного физиологического раствора (ЗФР), Обрабатывать лектином можно и криостатные срезы, которые готовят конвенциональными методами. С целью блокирования субтерминальных остатков О-галактозы и И-ацетил-О-галактозаминэ перед обработкой срезов меченым лектином бузины черной проводится их инкубация в растворах нативных лектинов (не коньюгированных с пероксидазой) арахиса и сои в течение 30 мин при концентрации лектинэ в инкубационной среде 50 мкг/мл. После отмывания избытка лектинов арахиса и сои в двух порциях ЗФР срезы обрабатывают коныюгатом лектина бузины черной с пероксидазой, активность пероксидазы проявляют с помощью диаминобензидина в м об- раль- афин АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Львовский государственный медицинский институт(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ СИАЛОВЫХ КИСЛОТ В ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗАХ Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к гистологии, цитологии, змбриологии, патоморфологии, и может быть использовано для избирательного выявления сиаловых кислот в срезах тканей и органов.Цель изобретения - повышение селективности выявления сиэловых кислот,Существенным отличием предлагаемого способа является то, что для избирательного выявления остатков сиаловых кислот в составе молекул гликополимеров проводится предварительное блокирование свободных терминальных остатков О-галактозы и й-ацетил-О-галактозамина нативными лектинами арахиса и сои, а затем выявляются остатки сиаловых кислот с помощью лектина бузины черной, коньюгированного с пероксидазой хрена.Способ осуществляется следующи разом, Из фиксированной в 10% нейт ном формалине и заключенной в пар(57) Облас медицина, змбриолог изобретен связывэни тозы и К-а кубации с арахиса и лектином с пероксид тивность и бензидинлокализац коричнево 809386 Априсутствии 0,0015% Н 202, Избыток преципитата хромогена удаляют в двух порциях Н 20, препараты заключают в сироп Апати либо, после дегидратации, в нейтральный канадский бальзам.П р и м е р, Из фиксированной в 10% нейтральном формалине и заключенной в парафин поднижнечелюстной слюнной железы овцы готовят срезы толщиной 7 мкм, помещают их в каплю дистиллированной воды на обезжиренное предметное стекло и высушивают в термостате при 42 С в тече. ние 24 - 72 часа. Затем срезы депарафинируют, инкубируют 30 мин в метаноле, содержащем 0,3% Н 202 и через спирты нисходящей концентрации доводят до ЗФР (состав ЗФР: 1 л Н 20, 8,0 г МС, 1 г МаНР 04, 0,2 г КС рН доводят до 7,5 с помощью 1 н НС). После этого срезы инкубируют 30 мин в растворах нативных лектинов сои и арахиса (не конъюгированных с пероксидазой), Избыток лектинов арахиса и сои удаляют путем двухкратного промывания срезов в ЗФР, Затем 45 мин срезы инкубируют в ЗФР, содержащем 100 мкгlмл лектина бузины черной. меченого пероксидазой, и отмывают в двух порциях ЗФР. Визуализацию рецепторов лектина бузины черной осуществляют путем инкубации срезов в ЗФР, содержащем 0,05 диаминобензидина тетрагидрохлорида и 0,15% Н 02 в течение 3 мин. Активность пероксидаэы, связанной посредством молекулы лектина с остатками сиаловых кислот гликоконьюгатов, выявляют по коричневым отложениям преципитата окисленного диаминобензидина, После удаления избытка хромогена в двух порциях Н 20 препараты заключают в нейтральный канадский бальзам. В местах локализации сиалогликанов после проявления описанной гистохимической реакции появляется насыщенная коричневая окраска. В местах, лишенных сиалогликанов, окрашивание отсутствует,В таблице представлены результаты сравнения эффективности различных способов выявления сиалогликанов в поднижнечелюстной железе овцы,Из таблицы видно, что при обработке гистологических препаратов поднижнече 30 ареактивны 40 45 50 5 10 15 20 25 люстной слюнной железы овцы 1% раствором альцианового синего при рН 2,5 очень значительно окрашиваются мукоциты, умеренно выраженную реакцию дают сероциты, кроме того окрашиваются и другие структурные элементы железы (коллагеновые и эластические волокна, десмоциты). При проведении метилирования при 37 С с последующей окраской препаратов альциановым синим очень интенсивно окрашиваются мукоциты, умеренно выраженную или слабо положительную реакцию дают сероциты и другие структурные компоненты железы, Обработка гистологических срезов лектином бузины черной, конъюгированным с пероксидазой дает интенсивную реакцию .со стороны мукоцитов, кроме того умеренно окрашиваются сероциты и другие структурные компоненты железы, Обработка препаратов нативными лектинами арахиса и сои, связывающими терминальные остатка О-галактоэы и й-ацетил-О-галактозамина, с последующей окраской лектином бузины черной, конъюгированным с пероксидазой, содержащих значительное количество сиаловых кислот, дает интенсивную реакцию со стороны мукоцитов, что и обеспечивает повышение селективности, остальные структурные компоненты железы Предлагаемый способ обладает большей селективностью по сравнению с известными, более удобен в техническом исполнении, позволяет дифференцировать сиалогликаны от других кислых гликопротеинов. Формула изобретения Способ выявления сиаловых кислот в гистологических срезах, включающий обработку срезов лектином бузины черной, коньюгированным с пероксидаэой хрена. о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения селективности способа, перед обработкой срезов лектином бузины черной их инкубируют в смеси нативных лектинов арахиса и сои, а сиаловые кислоты выявляют по коричневому окрашиванию после обработки диаминобенэидина тетрагидромлоридом.1809386 Паренхима железы Соединительнотканна стромафон Способ выявления сиалогликановКлетки выходных про- токов Волокнистые структу- ы Аморфное ве- щество Популяции де- смо- цитов Аналоги; Альциановый синий рН 2,5 Метил ирование /37 С/ + альциановый синий Метили рование. /60 С/ + омыление + +альциановый синий Метилирование /60 С/ + альциановый синий Прототип: Лектин бузины черной, коньюгированный с пероксидазой Предлагаемый способ: Нативный лектин арахиса и сои+ лектин бузины черной, коньюгированный с перокси азойПроизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Заказ 1284 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5