Способ получения онкоовариального кислоторастворимого альфа 2-глобулина

(19) (11) 4 ГГ-в; - - .л ,Лл 1 лллллл. ллт.;Чк;т 1. БРЕТЕНИ ОПИ Н АВТОРСКОМ ИДЕТЕЛ ЬСТВ 1 5 -ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(71) 2-й Московский государственный медицинский институт им. Н,И, Пирогова(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОНКООВАРИАЛЬ НОГО КИСЛОТОРАСТВОРИМОГОАЛЬФА-ГЛОБУЛИНА(57) Использование: в медицинской биохимиидля выделения из тканей онкоавариальногокислоторастворимого альфа-глобулина, необходимого для разработки специфическойиммунодиагностики, Цель изобретения: получение нового опухолеассоциированного кислоторастворимого антигена. Сущностьизобретения: экстракт опухолевой и метастатической ткани первичной аденокарциномыяичников прогревают на кипящей водяной.бане 5-20 мин при 95 С, Прогретый экстракт. Изобретение относится к медицине, аименно к медицинской биохимии и можетбыть использовано для выделения из тканейонкоовариального кислотарастворимогоальфа-глобулина (КРАГ),Цель изобретения - разработка способаполучения онкоовариального кислоторастваримого альфа-глобулина,Поставленная цель достигается описываемым способом получения КРАГ из опухалевой и метастатической ткани первичнойаденакарциномы яичников путем прогревания экстрактов на кипящей водяной бане15(5 - 20 мин) при 95"С, обработки прогретого экстракта равным объемом 10 (15;) трихларуксуснай кислоты, осаждениянерастворимой фракции центрифугирава 55 А 61 К 37/02, 35/5 обрабатывают равным объемом 5-15 трихлоруксусной кислоты. Осаждают нерастворимую фракцию центрифугированием. Фракционируют кислоторастворииую фракцию сульфатом аммония. Растворяют осадок в минимальном объеме дистиллированной воды и подвергают гель-фильтрации его на колонке с сефадексом 0-100. Осаждают сульфатом аммония фракции, содержащие КРАГ. Растворяют осадок в дистиллированной воде с последующей гель-фильтрацией его на колонке с сефадексом 6-200 в летучем 0,05-0,2 М аммонийацетатном буфере (рН 5,0-7,0) и лиофилизацией фракции, содержащей целевой продукт. Положительный эффект: изобретение позволяет в обычных лабораторных условиях с помощью доступных реактивов получать новый онкоовариальный кислоторастворимый белок человека,нием, фракционирования кислоторастворимой фракции сульфатом аммония (210 - 300 г/л), растворения осадка в минимальном объеме дистиллированной воды и гель- фильтрации его на колонке с сефадексом Ж, осаждения сульфатом аммония (210 - 300 г/л) фракций, содержащих КРАГ, растворения осадка в дистиллированной воде с последующей гель-фильтрацией его на колонгке с сефадексом Жв летучем 0,1 М (0,05 - 0,2 М) аммоний-ацетатном буфере (рН - 5,0 - 7,0) и лиофилизацией фракции, содержащей целевой продукт,В процессе разработки способа удалось полностью избежать диализа. Эта процедура не только длительная, но и негативна влияет на.нативность многих белков. Всеагапы данного способа выстроены таким образом, что воспроизведение его до получения целевого продукта занимает 16-20 ч. Новым в предлагаемом способе является то, что в результате последовательного применения описанных этапов в течение 16 - 20 ч из экстрактов аденокарциномы яичников или ее метастазов в сальник можно получить новый опухолеассоциированный кислоторастворимый альфа-глобулин с чистотой препарата 65-80% и выходом 16,6 - 250 , Новый онкоовариальный кислоторастворимый антиген необходим для разработки специфической иммунодиагностики рака яичников.При отработке отдельных этапов способа проверены и.обоснованы параметрические значения концентраций, время, температуры, рН, ионной силы и т,д.П р и м е р 1, 100 мл экстракта аденокарциномы яичников, содержащим 30 мг КРАГ, заливают в колбу и помещают в водяную баню, которую разогревают до кипения. Экстракт в колбе периодически перемешивают и замеряют температуру непосредственно в экстракте. При подъеме температуры в экстракте до 95 - 97 С нагрев подолкают в течение 5 мин, Колбу с экстрактом извлекают из бани, охлаждают до 18 С и приливают равный объем 5% трихлоруксусной кислоты. Тщательно перемешивают, осадокотделяют центрифугированием и доводят рН кислоторастворимой фракции с помощью 2,0 М едкого натра до рН 7,0. Добавляют сухую соль сульфата аммония из расчета 210 г/л, через 30 мин после полного растворения соли осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 10 мл дистиллированной воды и наносят на колонку с сефадексом Ж. Объединяют фракции, содержащие КРАГ, добавляют сульфат аммония до концентрации 210 г/л, инкубируют 1 ч, центрифугируют, осадок растворяют в 5 мл дистиллированной воды и подвергают повторной гель-фильтрации на сефадексе Жв летучем аммоний-ацетатном буфере (0,05 М, рН 5,0). Объединяют фракции с молекулярной массой 52-58 кД и лиофилизируют, После лиофилизации получено 7,1 мг белкового порошка, По данным дискэлектрофореза в полиаркиламидном геле чистота препарата КРАГ составила 700 , Следовательно, из 7,1 мг белкового порошка на долю КРАГ приходится 5 мг, что составляет 16,6% выхода,П р и м е р 2, 100 мл экстракта аденокарциномы яичников, содержащим 30 мг КРАГ, заливают в колбу и помещают в водяную баню, которую разогревают до кипения, Экстракт перемешивают и замеряюттемпературу непосредственно в экстракте, При подъеме температуры до 95 - 97 С нагревпродолжают в течение 15 мин. Экстракт охлаждают до 18 С и приливают равный объем10% трихлоруксусной кислоты. Перемешивают осадок отделяют центрифугированиеми доводят рН до 8,0. Добавляют сульфатаммония 270 г/л, после полного растворения соли осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 10 мл"О дистиллированной воды и наносят на колонку с сефадексом Ж, Объединяют фракции, содержащие КРАГ, добавляют сульфатаммония (270 г/л), инкубируют 1 ч, центрифугируют, осадок растворяют в 5 мл дистил 15 лированной воды и наносят на колонку ссефадексом Жв летучем аммоний-ацетатном буфере (0,1 М, рН 6,0), Объединяютфракции с молекулярной массой 52-58 кД илиофилизируют. После лиофилизации пол 20 учено 7,5 мг белкового порошка, По даннымдиск-электрофо реза в пол иакриламидномгеле чистота препарата КРАГ составила80%, Следовательно из 7,5 мг белкового порошка на долю КРАГ приходится б мг, чтосоставляет 20% выхода.П р и м е р 3, 100 мл экстракта аденокарциномы яичников, содержащим 30 мг КРАГ,заливают в колбу и нагревают, как в примерах 1 и 2, После охлаждения экстракта кЗО нему приливают равный объем 15% трихлоруксусной кислоты, К полученной кислото, растворимой фракции добавляют сульфатаммония из расчета 300 г/л и полученныйосадок, растворенный в 10 мл дистиллиро 35 ванной воды, хроматографируют на колонкес сефадексом Ж. Объединяют фракции,содержащий КРАГ, осаждают его сульфатомаммония (300 г/л), осадокрастворяют в 5 млдистиллированной воды и хроматографиру 40 ют на сефадексе Жв летучем аммонийацетатном буфере (0,2 М, рН 7), Собираютфракции с молекулярной массой 52-58 кД илиофилизируют. После лиофилизации получено 11,5 мг белкового порошка, По дан 45 ным диск-электрофореза вполиакриламидном геле чистота препаратаКРАГ составила 650 , Следовательно из 11,5мг белка на долю КРАГ составила 65%, Следовательно, из 11,5 мг белка на долю КРАГприходится 7,5 мг, что составляет 25% выхода,П р и м е р 4, 100 мл экстракта из тканиметастазов первичного рака яичников всальник, содержащим 20 мг КРАГ, заливают55 в колбу и подвергают нагреванию, Далеевсе этапы аналогичны приведенным в примере 2. После лиофилизации получено 5 мгбелкового порошка. По данным электрофореза в поилакриламиднам геле чистота препарата КРАГ составила 800 ,1808333 Составитель П.ПрокопенкоТехред М.Моргентал Корректор С,Пекарь Редактор Заказ 1231 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 РПроизводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 Следовательно, из 5 мг белкового порошка на долю КРАГ приходится 4 мг, что составляет 20 выхода.Данный способ может быть применен для выделения КРАГ и из сыворотки крови. Однако концентрация его в сыворотке крови больных раком яичников составляет всего лишь 0,02 - 0,08 мг/л и выделение его из сыворотки крови представляет интерес скорее теоретический, исключительно для аналитических целей. Другого биологического материала, из которого можно было бы его получать, пока не найдено,Контроль за чистотой препарата на этапах выделения осуществляли иммунохимичес кими методами и с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, Количественное определение КРАГ проводили иммунохимическими методами,Опыты по получнию моноспецифических антисывороток при использовании в качестве антигена препарата КРАГ, выделенного по описанному способу, показали, что препарат обладает достаточной нативностью, высокой иммуногенностью, а полученные антисыворотки - высокой специфичностью,Предлагаемый способ позволяет в обычных лабораторных условиях с помощью доступных реактивов получать новый онкоовариальный кислоторастворимый белок человека. КРАГ необходим для получения к нему моноспецифических антисывороток, которые будут использованы для 5 разработки специфических методов иммунодиагностики рака яичников и исследований в области экспериментальной онкологии и медицины.формула изобретения 10 Способ получения онкоовариальногокислоторастворимого альфа-глобулина, включающий предварительное прогревание при температуре 95-97 С экстрактов из опухолевой или метастатической ткани пер вичной аденокарциномы яичников в течение 5 - 20 мин, осаждение балластных белков 2,5 - 7,5 трихлоруксусной кислотой, внесение в кислоторастворимую фракцию сульфата аммония в концентрации 210 - 300 20 г/л, растворение образовавшегося осадка вминимальном количестве дистиллированной воды и проведение гель-фильтрации на колонке с сефадексом 6-100, сбор фракций, содержащих альфа-глобулин, повторную 25 обработку сульфатом аммония в той же концентрации, проведение гель-фильтрации растворенного осадка на сефадексе 0-200 в летучем аммоний-ацетатном буфере, сбор фракций с мол.м. 52-58 кД и лиофизирова ние.