Способ определения токсичности водорастворимых веществ

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 178 у 5 ОО,СО 505 С 18 БРЕ Я СВИДЕТЕЛЬСТВУ К АВТОРС ОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕЕДОМСТВО СССРОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ И(56) Строганов Н,С., Дмитриева А,Г., Король В,М. Водоросли и макрофитц как обьектц для биотестирования, Волгоград, 1983, с,153-158.Пакхам Е,ДДуксбури С.О., Майфилд С, О, и др. Количественный анализ вызванных загрязнителем летальных и сублетальнцх поражений культивируемых клеток млекопитающих: Экспресс-информация ВНИИМИ. Гигиена окр. среды, М 6, - М., 1983, с, 26. Изобретение относится к способам определения биологической активности соединений в водной фазе и может быть использовано в токсикологии, охране окружающей среды; экологии, химико-фармакологической промышленности, при санитарно-гигиенических исследованиях в научно-практических учреждениях санитарно-гигиенического надзора,Известен способ определения токсичности жидкостей путем обработки токсикантом микро- и макроводорослей с подсчетом соотношения живых и мертвых клеток и некротизированных участков. Известен способ оценки токсичности водорастворимцх соединенйй путем обработки токсикантом культивируемых млекопитающих с последующей инкубацией и определением репродуктивной гибели клеток. 54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВЕЩЕСТВ(57) Использование: токсикология, охрана окружающей среды, экология, химико-фармакологическая промышленность, санитарно-гигиенического надзора. Сущность изобретения: клетки млекопитающих, культивируемые Не 1 а, помещают в жидкую питательную среду (20-30 клеток/мл). Туда же добавляют 1: 50 - 1; 100 (в мас, ф) раствор токсиканта. Образцы инкубируют до появления макроколоний, 2 табл. Цель изобретения - упрощение, повышение экономичности и точности "способа определения токсичности водорастворимых веществ.Способ заключается в следующем. Бе рут клетки млекбпитающйх Не 1 а, культиви- О руемце 1 п чего, помещают в жидкую (Я питательную среду вравнойкойцентрации (Л (20-30 мл/мл) в контрольных и опытных об разцах. Выбор такой плотности связан с тем, что.повышенйе плотнбсти ФЙводит к " снижению точнбсти за счет слйянияколоний; при снижении плотности также происходит снижение сочности определения за " счет уменьшения эффективности посева, Затем в опытные пробирки с инокулированными добавляют в соотношении 1: 50-1: 100 (в мас, ) раствор токсиканта (0,1-0,05 мл раствора испытуемого вещества,содер-" " жащего такую концентрацию, которая приуказанной операции разбавления создаетвыбранную рабочую концентрацию), В контрольные пробирки в том же соотношениидобавляют солевой раствор, используемый.для приготовления растворов токсиканта, 5После этого образцы инкубируют в герметически закрытых сосудах при 37,0-37,5 С втечение времени, необходимого для появления макроколоний, и судят о токсическомдействии соединения при статическом достовернбм отклонении числа колоний в присутствии токсиканта по сравнению сконтрольным образцом,Предлагаемый способ определения токсичности водорастворимых веществ имеет 15явные преимущества перед известным, чувствительность способа повышается в 30раз, Материалы, представленные в таблице,иллюстрируют достижение цели,Предлагаемый способ более экономичен, так как отпадает необходимость в использовании дорогостоящего оборудованиядля создания стерильной газовой среды постоянного состава и влажности в термостатируемой камере, более прост, так как не 25содеркит операций, необходимых для создания различных концентраций клеток вопытных и контрольных образцах, а такжеопераций, связанных с внесением токсиканта в физиологическом растворе, а затем 30заменой раствора на среду культивирования, потому что в предлагаемом способетоксикант вносят непосредственно весьсрок инкубации до появления видимых макРОКОЛОНИЙ, 35П р и м е р 1, Для подготовки культурыклеток Неа берут в виде монослоя в стеклянном матрасе емкостью 0,5 л в среде следующего состава: среда 199-45 %, средаИгла 48 %, сыворотка крупного рогатого 40скота без консерванта 7 %, стрептомицинапо 250 ед/мл, На третий день культивирования клетки снимают со стекла 0,25 %-раствором трипсина, ресуспендируют впитательной среде, разбивают комки клеток 45пикетированием, подсчитывают число клеток е 1 мл и готовят суспензию одиночныхклеток в культуральной среде с плотностью20 клеток/мл, по 5 мл суспензии клеток, т, е.100 клеток на пробу, инокулируют в 10 камер, 5 из них служат контролем, в 5 вносят5 х 10 мг процента хлорофоса. Клетки культивируют при 370 С до появления видимыхневооруженным глазом макроколоний, затем подсчитывают число выросших колоний 55е, контрольных и опытных камерах, Среднеечисло колоний в контрольных пробирках 98,+ 1,16, среднее число колоний в опытныхкамерах 82 А+ 1,5, т, е. выживаемость клеток при действии хлорофоса в концентра-ции 5 х 10 в мг % равна 84,2 % от контроля,Получают нижний пред 9 ел определения хлорофоса, равный 5 х 10 мг %.Предлагаемый способ пв сравнению сизвестным имеет повышенную чувствительность при упрощении определения токсичности водорастворимых веществ,П р и м е р 2. Осуществляют, как пример1, но в опытные камеры вносят 107 мг ф хлорофоса, контрольные и опытные пробыкультивируют около 8 дней, Среднеечисло колоний в контрольных пробир-ках 98,0 ф. 1,6, в опытных 48,2+1,8, т, е.выживаемость равна 46,1 от контроля, чтосвидетельствует о высокой токсичностиданной концентрации хлорофоса на репродуктивную способность клеток млекопитающих.П р и м е р 3. Осуществляют, как пример1, но в опытные пробирки вносят 5-метокситритамин в концентрации 1 х 10 мг 0 .Среднее число колоний в контрольных пробирках 91,1 + 2,2, в опытных - 42,21,4 т,е, выживаемость равна 46,1 %, высокотоксичное соединение,П р и м е р 4, Осуществляют, как пример1, но в опытные пробирки вносят 2-амиачно 2-тиазолин 10 з мг 0 и получают выживаемость 49 % по сравнению с контролем,П р и м е р 5, Осуществляют, как пример1, но в опытные камеры не вносят токсикант, а производят замену среды на свежуюсреду того же состава, После образованиявидимых макроколоний производят их подсчет в опытных и контрольных камерах. Вконтроле среднее число колоний составляет 82,0 +6,3, вопытах,8+ 5,9, т. е,91,20 от контроля, Таким образом, процедурасмены среды приводит к снижению числаколоний порядка 10 %.П р и м е р 6, Осуществляют, как пример1, лишь суспензию одиночных клеток берутв концентрации 30 клеток/мл. Выживаемость клеток приздействии хлорофоса в концентрации 5 х 10 мг% равна 84,1+ 0,1, чтосвидетельствует о высокой сходимости результатов в диапазоне клеток в концентрации От 20-30 клеток/мл (сравнение спримером 1). Данные об эффективности ипосева в этих Опытах приведены в таблице.Из данных, представленных в таблице,следует, цто именно квнцентрация 20-30клеток/мл дает допустимук эффективностьпосева и наглядно иллюстрирует преимущества предлагаемого способа по,сравнениюс прототипом,Температура культивйрвеания для клеток млекопитающих допустима в приведенных пределах. Время культивирования1789559 Формула изобретения Таблица 1 Таблица Составитель В,Юди Техред М,Моргентал Корректор З,Салк эктор Г,Бельск каз 329 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ С 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул. Гагарина, 10 клеток зависит от токсиканта, поэтому отмечают появление видимых макроколоний(порядка 8-10 дней со дня посева, но не более Способ определения токсичности водо- растворимых веществ, предусматривающий культивирование клеток млекопитающих, внесение суспензии клеток в термостатируемые опытные и контрольные камеры на период, необходимый для прикрепления клеток, внесение в опытные камеры исследуемого раствора и инкубацию его с последующей оценкой числа макроколоний в 12 дней, так как после этого колонии из-заизменения рН сползают со стекла и их невозможно подсчитать). опытных и контрольных камерах и отнесение исследуемого раствора при достоверном уменьшении количества макроколоний в опытных камерах, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целю упрощения и повышения точности способа, культивируют клетки человека Неа, в качестве термостатируемых камер используют герметично закрытые сосуды, суспензию клеток вносят в концентрации 20 - 30 клеток(мл, а инкубацию проводят до появления видимых микроколоний.