Способ диагностики туберкулеза

)1 б 01 К 33 535 НИЯ О ВТОР 5учно-ислеза .Черноуов, Н.В ледовательсова, В.И,Го- Куликовская актерио Приказ ческихСССР ИКИ ТУБЕРКУЛ я к области меди- но к способам опий туберкулеза. яется ускорение ствительности диьтивирования мимокроты, методом нтного анализа в яют антигены миложительные ре получить в срокиположительных р месяцев.Целью изобре способа и повыше агностики туберкуСпособ осуще С ,С ом реде для кулметодом непферментногоели определяпомощью моантител из г тивирования рямого твер анализа (ИФ ют антиген м ноклональны периммуннь микобакдофазного. А) в сроки икобактеиммун1-3 нед и с антите) сыворо МТГОСУДАРСТВЕННОЕ Г)ЛТЕНТНО8 ЕДОМСТВО СССР(71) Центральный нский институт туберк(56) Об унификации бтодов исследования.М. 558, 1978,(57) Изобретение относитс цины и биологии, а имен ределения микобактер Целью изобретения явл способа и повышение чув агностики, В среде для кул кобактерий после посева непрямого иммуноферме сроки 1-3 недели определ Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно, к способам определения микобактерий туберкулеза.Прототипом данного метода является определение микобактерий в мокроте бактериоскопическим и бактериологическим методами.Однако при массовом исследовании бактериоскопический метод дает только 40- 60; положительных результатов, а результаты бактериологического исследования (посева) бывают положительными только у половины больных с положительным результатом бактериоскопии и лишь у 10-20% с отрицательным результатом. При этом покобактерий туберкулеза с помощью моноклональных антител МГи антител из гипериммуных сывороток к микобактериям туберкуле за штамма Н 37 ВЧ, Для этого на полистироловые 96-луночные планшеты наносят моноклональные антитела, затем смыв с питательной среды, на которую была посеяна мокрота больного, затем антитела из гипериммунной сыворотки к микобактериям туберкулеза, реакцию проявляют антителами против глобулинов кролика, меченными пероксидазой хрена и истощенными на глобулинах мыши. После добавления ортофенилендиамина с перекисью водорода измеряют оптическую плотность окрашенного раствора при длине волны 492 нм. Превышение оптической плотности на 0.2 единицы и больше по сравнению с контролем считают положительной реакцией. По сравнению с прототипом сокращаются сроки диагностики туберкулеза в среднем в 2 раза. 1 табл. ультаты посева удаетот 2-Зх недель (5070 средзультатов посева) - до 2 ения является ускорение ние чувствительности дилеза.твляют следующим обра 1780006ток к микобактериям туберкулеза нида бцгпяп штамма НЗУРУ. В качестве диагностических иЗег 1 арятов исгользуют монокло нальнце антитела к антигену микобактерий - МТ(регистрационный М 488 Д во Всесоюзном банке клеочнх культур) и глобулинову:о фракци 1 о, полученнуо осяжденлем сульфатом аммония при ЗЗ /, насыщении из гипериммунных сывороток к микобактериям туберкулеза штамма Н 37 Р, Для определения микобактерий туберкулеза мокроту после обработки в щелочной соеде заливаот в количестве 0,2 мл на плотную питательную среду с добавлением жидкой питательной среды Екольникова с 10- ,1 ым содержанием плязмц. Культуральчу 1 о ;кидкость исследуют, нячлная с 1-ой недели. При постановке ИФА на полистироловые г 1 ланшетц наносят 25 мкл моноклональных антител МТв концентрации 100 мкг/мл, и инкубируют 1 ч в теомостате при 37 С, зягем отмцва 1 ст трижды (50 мкл) забуференным физиологическим растВОром с 0,05 оу.-твина(ЗсзР-твин) и в течение 1 ч блокиру от раствором ЗФР-твин с 0,5,4 бычьего сцвороточкого альбумина (ЗЗР- твин-БСА), после ОтмыВания ЗЭР-тВином (трижды по 50 мкл) в лунки наносят по 25 мкл культурялькой жидкости, инкубиру 1 от в течение 1 ц при 37 С и после отмывания ЗФР-твином (трижды по 50 мкл) наносят по 25 мкл глобулиновой фракцли кроличьей гипериммунной сыворотки к микобактериям 1 уберкулеза видя Ьшгпапцз, штамма Н 37 Р. После иккубяции В течениечаса в термостате и отмь 1 вания 3 ФР-твином (трижды по 50 мкл наносят по 25 мкл антител, против глобулинов кролика, и меченных пероксидазой хрена и истощенных на глобулинах мыши. Госле иккубации в течение ча "а в термостате и ОтмыВания ЗОР-ТВинОм (трикды по 50 мкл) реакци 1 О проявляют добавлением субстрата25 мкл ортофенилендиамина с перекисью водорода в цитратно-фосфатном буфере рН 5,0, Реакцию останавливают добавлением 25 мкл 1,25 Н серной кислоты, Реакцию оценивают спектрометрически при длине волны 492 нмП р и м е р 1, Производят забор мокроть и посев ее, Начиная с 1-ой недели, исследу 1 от культуральную 1 кидкость ка наличие микобактерий туберкулеза, сравнивая с отрицательным и положительным контролем. Вкачестве отрицательного контроля используют культуральную жидкость после посева5 мокроты от больного хроническим бронхитом, в качестве положительного - стандарт -специально отобранную культуральнуюжидкость после посева мокроты от больноготубеокулезом легких, Превышение уровня10 иммуноферментной реакции на 0,2 единицыоптической плотности и больше, чем в отрицательном контроле, свидетельствует о положительной реакции. Использованиеположительного контроля необходимо для15 проверки точности проведения реакции.Так, было обследовано 64 больных туберкулезом легких (инфильтративный иочаговый, впервые выявленный) - окончательный диагноз был установлен на основе20 комплекса клинико-лабораторных признаков и результатов лечения. Результаты сопоставления бактериологического ииммунологического исследований представлены в таблице,25 Таким образом, предложенным способом было выявлено 49 случаев туберкулезаиз 64-х, причем в срок 2 недели у 504 больных. по сравнению с 23 у, больных, выявленных бактериологическим методом. У30 больных хроническим бронхитом микобактерии в мокроте обнаружены не были.Сопоставление результатов определения микобактерий микробиологическим ииммуноферментным методами (исследова 35 ны кульгуры от 64 больных) приведено втаблице,Формула изобретенияСпособ диагностики туберкулеза, включающий забор крови, высев ее на селектив 40 ную среду, инкубирование с последующимвыявлением бактерий туберкулеза, о т л ич а 1 о щ и й с я тем, что, с целью повышениячувствительности способа и сокращениявремени диагностики, после инкубирования45 производят смыв, выявляют в нем антигеныбактерий туберкулеза иммуноферментнымметодом с фиксированными на твердой подложке моноклональными антителами типаУГс вторичными антителами из гиперим 50 мунной сыворотки к микобактериям туберкулеза штамма Н 37 КЧ и при наличииантигена диагностируют туберкулез..К Реда Заказ 4433 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 л,Гагарина, 101 ательский комбинат "Патент", г. Уж оизводственн Составитель В,Лито Техред М,Моргентал нко Корректор Т,Пали