Способ получения декстраназы

( 9) и 1) СПУБЛИ т ИЗОБРЕТЕВИДЕТЕЛЬСТВУ ИЕ И ТОР СУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИоОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯ И ГКНТ СССР Р 1) 4163218/13(71) Институт микробиологии АН БССР и Всесоюзный научно-исследовательский институт биотехнологии(72) А.Г. Лобанок, О,Н. Зинченко, В.И. Шишло, З,А. Рожкова, Г.А, Молодова, Т.И. Данилова, А.К. Хасирджаева и Е,И, Беленькая (56) Авторское свидетельство СССР М 747889, кл. С 12 й 15/00, 1978.Авторское свидетельство СССР .М 896069, кл. С 12 й 15/00, 1980.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕКСТРАНАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения декстраназы из микромицетов. С целью повышения активности декстраназы, увеличения выхоИзобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения декстраназы из микромицетов,Целью изобретения является повышение активности декстрэназы, увеличениевыхода конечного продукта и упрощениепроцесса.Сущность изобретения заключается виспользовании штамма Азрегццз лзцетцзВКПМ Р, который выращивают на питательной среде с полиглюкином и автолизатом дрожжевым или ферментолизатомбиомассы микроорганизмов. Низкомолекуляриый декстран полиглюкин, в отличие отвысокомолекулярного нативного декстрана,выпускается отечественной промышленностью (МРТУ 42 Ь 3548-67). Он являетсяединственно доступным в СССР полимеромдекстрановой природы. Втамм Азр. я)л С 12 ГЧ й/46, 1/14 О С 12 Ы 9/4 В 166) да конечного продукта и упрощения процесса, в качестве продуцента используют штамм-продуцент Азрегдцз пзцетцз ВКПМ Г, являющийся вариантом штамма Азрегццз пзцетцз Е, который выращивают на питательной среде, содержащей в качестве индуктора низкомолекулярный декстран полиглюкин в количестве 0,4- 0,6 О/б а также автолизат дрожжевого или фемеитолиза биомассы микроорганизмов в количестве 0,2 - 0,5 О/(у. Преимуществом предложенного способа является увеличе. ние декстраназной активности иа 20, увеличение выхода конечного продукта в среднем на ЗОО/ь, снижение концентрации индуктора в питательной среде в 2 раза и сокращение сроков культивирования нэ 20-22 У. пзцетцз ВКПМ Рявляется вариантом - д штамма Азр, пзцетцз Г. Депонироваи в д 4 коллекции микроорганизмов Всесоюзного (Я научно-исследовательского института ге- О нетики и селекции промышленных микроорганизмов,Получение штамма.Суспензию спор гриба Азр, пзцевз Г- Ю 118 рассевали ив чешки Петри с вгвриаовви.иой средой Чапека.Доков, содаргкащей в качестве источиика углерода голубой де.кстран, Добивались получения отдельных колоний, После 4 сут выращивания отбирали наиболее крупные колонии с широкой зоной просветления среды вокруг иих. Наличие таких зои свидетельствует о гидролыЗе содержащегося в,среде дежстрйиз выделенным в питательную среду фермеи" том декстраназой, Каждую отобранную колонию пересевали на скошенный картофельно-декстроэный агар. выращивали при26 С в течение 2-х недель. затем проверялидекстранаэную активность, культивируяштамм на качалке, в жидкой питательнойсреде двух вариантов;1 - питательная среда с 0,5% полиглюкина;2 - питательная среда с 0.5% полиглюкина и 0,5% автолиэата дрожжевого илиферментолйзата бйомассы микроорганизмов.Таким образом, был отобран штамм, накапливающий большое количество декстраназы (до 100 ед/мл) при культивировании втечение 96 ч на питательной среде 2.Штамм Азр пзоо 1 цз ВКПМ Гхарактеризуется следующими культурноморфологическими и биохимическимипризнаками:Морфологические признаки,Нэ среде Чапека-Докса мицелий белый,септированный. Конидиеносцы прямостоящие, толщиной 3,0 - 4,0 мкм, несептированные. Конидиальная голов;а овальная,образована вершинным вздутием конидиеносца, Размеры головки (8-9) (7 - 8) мкм,стеригмы 14,0 - 7,0 мкм расположены одним слоем, бесцветные, конидии окуглые,гладкие, диаметром около 5,0 мкм.Культуральные признаки,Агар Чапека-Доксэ с сахарозой. Пятисуточная колония диаметром 2,8 - 3,0 см,Колония круглая, пушистая, выпуклая, воз 1душный мицелий белый, На 6-е сутки ростапри 28 С колония достигает диаметра 3,23,4 см, в центре появляется зона спороношения сероватого цвета.Картофельно-декстрозный агар, На 5-есутки при 28 С колония имеет диаметр 2,5 -2,7 см, профиль колонии выпуклый, краяровные, рост концентрический, воздушныймицелий серо-коричневого цвета, по краюколонии белый, к 6-и суткам центр колонииболее светлый, диаметр 2,8-3,0 см,Агар Чапека-Докса с декстраном, Четырехсуточная колония круглая, белая, пушистая, выпуклого профиля, а ровнымикраями, диаметр колонии 3,2-3,5 см, вокругколонии зЬна просветления декстрана шириной до 8,0 мм, В центре колонии на 5-6-есутки появляется конидиеносная зона диаметром до 1,5 см,Физиолого-биохимические признаки.Азрегдцз пзцесоз ВКПМ Ргидролиэует крахмал, молоко свертывает на 6-есутки, желатину разжижает воронкообразно, Использует аммонийную, нитратную ибелковую формы азота, Нитраты восстанавливает. Активно ассимилирует глюкозу, са 40 45 50 55 парата составляет 1 г/л КЖ,П р и м е р 2. Культивирование штамма Азр, пзое 1 оз ВКПМ Гв оптимальных условиях,Гриб выращивают на качалке при 2000 об/мин в течение 96 ч при 29 С в колбах емкостью 250 мл со 100 мл питательной среды следующего состава, %: полиглюкин 0,5; ИэОэ 0,3; КН 2 Р 04 0,1; КС 0,05; Мд 50 7 Н 20 0,05; автолизат дрожжевой0,3, рН 5,0. Получают КЖ с активностью декстраназы 98 ед/мл, выход препарата после осаждения спиртом составляет 1,55 г с 1 л КЖ.Исследования показали, что для обоих продуцентов в качестве индуктора синтеза декстрэназы можно использовать полиглюкин взамен нэтивного декстрана. При внесении в питательную среду в количестве 1% они дают практически одинаковые резульхарозу, мальтоэу, лактоэу, арэбинозу, ксилозу, маннит и глицерин.Условия хранения штамма,Штамм поддерживают на картофельно 5 декстроэном эгаре или агаре Чапека-Доксэпри 26 С.Штамм Аер. пзоемз ВКПМ Г.342 нетоксичен, тэк как получен иэ исходного нетоксичного штамма Авр, пвоемв Гбез10 применения мутагенных факторов.Сущность предлагаемого способа заключается в том, что продуцент Авр.пзцетоз ВКПМ Гкультивируют в колбахв течение 93-96 ч или в ферментерах в15 течение 60 - 70 ч на питательной средеследующего состава, %: полиглюкин 0,40,6; МаИОэ 0,3; КН 2 Р 04 0,1; КС 0,05;МдЯО 4 7 Н 20 0,05; автолизат дрожжевойили ферментолизат биомассы микроорга 20 ниэмов 0,2 - 0,5.Декстраназную активность выражают вглюкозных единицах. Единица активностисоответствует количеству освободившихсяпри действии фермента на субстрат восста 25 навливающих групп при 37 С за 1 мин, эквивалентному одному микромолю глюкозы.П р и м е р 1 (контроль). Культивирование штамма Азр, пзоем Гв оптимальных условиях,30 Гриб выращивают на качалке при 200об/мин в течение 120 ч при 29 С в колбахемкостью 100 мл с 25 мл питательной средыследующего состава, %.; нативный декстран 1,0; ИайОэ 0,3; КН 2 РОп 0,1; КС 0,05;МдЯ 04 7 Н 20 0,05, рН 5,0. Культурэльную жидкость (КЖ) с активностью декстраназы 80 ед/мл отделяют фильтрованием. Конечный продукт осаждают этиловым спиртом известным способом, при этом выход пре1756355 Составитель В,СоинаТехред М.Моргентал Корректор Н.Гунька Редактор Н.Рогулич Заказ 3062 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-иэдательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 таты, Однако особенностью предлагаемого штамма Азр.1 пзцетцз ВКПМ Рявляется то, что максимум накопления фермента достигается уже на 4-е сутки культивирования, т.е. происходит сокращение срока культивирования на 24 ч по сравнению с Азр, 1 пзцетцз Г. Кроме того, предлагаемый штамм, в отличие от исходного, обладает способностью к повышенному синтезу декстраназы при культивировании на питательных средах,. содержащих композицию полиглюкина и автолиэата дрожжевого или ферментолизата биомассы микроорганизмов. Введение в питательную среду этих недефицитных веществ позволяет в 2 раза снизить концентрацию индуктора при использовании предлагаемого цтамма. На питательных средах с 0,4-0,6 / полиглюкина и 0,2-0,5% автолизата дрожжевого или ферментолиэага биомассы микроорганизмов уровень активности декстраназы в КЖ Азр, 1 пзцетцз ВКПМ Рдостигает своего максимального значения (96-100 ед/мл), При этом выход конечного продукта увеличивается в среднем на 30%, срок культивирования сокращается на 24 ч, При концентрации полиглюкина менее 0,4% и автолизата дрожжевого или ферментолиэата биомассы микроорганизмов менее 0,2% снижается как активность декстраназы, так и выход конечного продукта, Увеличение концентрации полиглюкина выше 0,6% и автолизата дрожжевого или ферментолизата биомассы микроорганизмов выше 0,5% также приводит к снижению активности декстраназы.При культивировании продуцента Азр, 1 пзцефцз ВКПМ Гменее 96 ч активность в куль туральной жидкости не достигает своего максимального значения,При культивировании Азр, 1 пзцешзВКПМ Рв ферменте на питательной сре 5 де с 0,5 полиглюкина и 0,4 автолиэатадрожжевого за 60-70 ч роста достигаетсямаксимальный уровень активности декстраназы в культуральной жидкости 60-80ед/мл, при выходе конечного продукта 1,410 1,6 г/л, в то время как максимум активностидекстраназы Азр, 1 пзцетцз Гпри выращивании в аналогичных условиях достигается к 75-80 ч и составляет 40-45 ед/мл,Преимуществом изобретения являются:15 увеличение декстраназной активности на20 о , сокращение сроков культивированияна 20-22 , снижение концентрации индуктора в питательной среде в 2 раза и увеличение выхода конечного продую а в среднем20 на 30%,Формула изобретенияСпособ получения декстраназы, предусматривающий глубинное культивирование продуцента Азрег 911 цз 1 пзцетцз в25 аэробных условиях на питательной среде,содержащей индуктор декстраназы, источники азота, фосфора, минеральные соли домаксимального накопления активности, о тличающийся тем,что,сцельюповыше 30 ния активности декстраназы, увеличениявыхода конечного продукта и упрощенияпроцесса, в качестве продуцента декстраназы используют штамм Азрег 91 Ицз 1 пзцеОззВКПМ Г, в качестве индуктора - 0,4-0,635 мас,% полиглюкина, а в качестве источникаазота в питательную среду вводят 0,2-0.5%дрожжевого автолизата или ферментолизата биомассы микроорганизмов.