Способ определения кейлонов

П 9)ЯООи 1 И 33/48, А б 1 К 37 Я 2 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ и У 4,с.12 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИД(71) Владивостокский государственмедицинский институт(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КЕЙЛОНОВ (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения кейлонов. В основу способа,Изобретение. относится к медицине и может быть применено для выявления и тестирования кейлонов и других биологически активных веществ.Целью изобретения является повыше ние чувствительности и ускорение способа определения кейлонов,В основу способа определения кейлонов положена. впервые обнаруженная способность нормальных (неопухолевых) клеток, органов мыши (печень, сепезенка, тимус, легкое) под действием соответствующих кейлонсодержащих экстрактов (КСЭ) обеспечивать. краситель (метиленовую синь) в анаэробных (бескислородных) условиях.Способ осуществляют следующим образом.Готовят клеточную суспензию из печени, тимуса, легкого, селезенки мышей, затем готовят агар и выделяют ингибитор из органов животных (бык) положена способность нормальных (неопухолевых) клеток некоторых органовмыши под действием ингибиторов - кейлонсодержащих экстрактов (КСЭ)обесцвечивать метиленовую синь в анаэробных (бескислородных) условиях.Цель - повышение чувствительности и, ускорение способа. Ингибитор вносятв клеточную систему, представляющуюсобой взвесь клеток некоторых органов мышей. Клеточную систему соединяют с агаром специального состава, содержащим краситель, при этом регистрацию результатов проводят по изменению окраски агара. и органов морских млекопитающих по известному способу. Для выделениядействующего начала используют фракционированное спиртовое осаждение белковых компонентов водных экстрактов. После этого соединяют клеточную взвесь, КСЭ и агар, Затем проводят учет результатов по степени обесцвечивания столбика агара.П р и м е р 1. Приготовление клеточной суспензии; забивают мышь и фиксируют на столике. Выделяют отдельно селезенку, печень, легкое тимус, очищают их от жира и соединительной ткани, переносят в чашки Петри с 0,5-0,8 мл среды 199 и каждый орган фрагментируют ножницами до получения однородной клеточной взвеси. К полученной смеси добавляют 2-2,5 мл среды 199 и фильтруют ее через капроновую сетку в центрифужную пробирку. Дважды отмывают средой 199 при цент2270 4 не дает визуально регибрнруемые изме0 нения, т.е. просто не видна в пробир. ке. Концентрация метиленовой сини более 1;50000-1:60000 ведет к неполному,ее обесцвечиванию клетками и нарушению результатов реакции.55 3рифугировании в течение 5 мин приООО об/мин. Супернатант удаляют, ак осадку добавляют свежей среды 199и ресуспендируют пастеровской пипет"кой. В камере Горяева подсчитываютколичество клеток в одном миллиметреклеточной суспензии. Доводят концентрацию клеток до 250000-300000 в одноммиллнлитре разведением средой 199.Приготовление агара. Расплавляют0,5-1 й-ный агар на фосфатном буфере(1/15 М, рН 7) и к нему добавляют 34 .-ную глюкозу, После охлаждения агара до 45 С в среду вносят краситель(метиленовую синь) до конечного разведения 1:50000-1 Ф 60000,Выделение ингибитора. Кейлонсодержащие экстракты готовят из органовбыка и органов моржа. Для этого у животного выделяют селезенку, печень,легкое, тимус, промывают их теплымфизиологическим раствором. Затем измельчают ткань в гомогенизаторе, добавляя дистиллированную воду в соотношении 8:1, После замораживания при-2 ООС и оттаивания суспенэию пропускают через марлевый. фильтр.и измеря.ют конечный объем, исходя из которогодобавляют холодный 96 -ный этиловыйспирт до конечной концентрации 70 .оПосле выдерживания смеси при 4 С в тетечение 1 ч образовавшийся осадок от"делаот 10-минутным центрифугированиемпри 3000 об/мин. К надосадочной жидкости вновь добавляют 96 -ный зтанол,доводя его концентрацию до 81 . Осажденную 81 -ную спиртовую фракцию лиофильно высушивают. Из высушенныхэкстрактов делают навески 100, 200,300 мкг. Каждую навеску растворяют в0,5 мп физиологического раствора.Готовят ряд пробирок, наливают вкаждую 0,5 мл клеточной взвеси, затем в 1,2,3-ю пробирки вносят КСЭ доконцентрации 100, 200, 300 мкг в0,5 мл соответственно. В каждую пробирку добавляют по 2 мл агара. Конечная концентрация ингибитора составляет соответственно 33,3, 66,6,100 мкг/мл. В контрольную пробйркувместо КСЭ вносят 0,5 мл физиологи-ческого раствора, Такой ряд пробирокиспользуют для каждого набора клетокиз различных органов - печени, селезенки, легкого тнмуса - и добавляют впробирки соответствующие кейпонсодер"жащне экстракты иэ тканей животных.Пробирки помещают в термостат при 5 1 О 15 20 25 30 35 40 45 37 С, учет результатов проводят через сутки.В контрольной пробирке, содержащей физиологический раствор, столбик агара остается синим.В пробирке Р 1 с конечной концентрацией ингибитора 33,3 мкг/мл происходит обесцвечивание столбика агара на одну треть. Интенсивность реакции +.В пробирке Р 2 происходит обесцвечивание столбика агара на две трети (конечная концентрация ингибитора 66,6 мкг/мл). Интенсивность реакцииВ пробирке У 3 с конечной концентрацией ингибитора 100 мкг/мл происходит полное обесцвечивание столбика агара. Интенсивность реакции .П р и м е р 2, Все операции проводят аналогично примеру 1. Изменяют концентрации агара и глюкозы: 0,5-1 - ный агар обеспечивает необходимую диФФузию ингредиентов реакции, агар плотной концентрации (более 1 ) препятствует диффузии ингредиентов реакции, агар менее плотной концентрации не дает достаточной плотности состава, не удерживает ингредиенты, переместившиеся в результате диФФузии.3-4 -ная глюкоза используется как поглотитель кислорода, ее концентрация менее 3-4% не обеспечивает поглощения всего находившегося в растворе кислорода и не создает аназробных условий, концентрация глюкозы более 4 нарушает химическийсостав среды н препятствует прохождению реакции.П р и м е р 3. Все операции проводят аналогично примеру 1. Изменяют концентрацию метиленовой сини. Концентрация метиленовой сини в разве дении 1:50000-1:60000 дает возможность по изменившейся окраске, т.е. обесцвечиванию метиленовой сини, визуально оценивать результаты реакции. Меньшая концентрация метиленовой сини Данный способ позволяет повысить,чувствительность определения кейлоновв кейлонсодержащих экстрактах в 10Составитель А. СкуратРедактор И.Стрельникова Техред А.Кравчук Корректор С,Ыекмар Заказ 1580 Тираа ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР3035, Москва, 3-35, Раувская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат фПатентф, г.уагород, ул. Гагарина,01 51732270 6100 раз и ускорить его в 5 раз по лью повышения чувствительности спосо+ сравнению с прототипом. ба и его ускорения, в качестве кле" ф о р м у л а и з о б р е т е н и я точной системы используют взвесь клеСпособ определения кейлонов валю " ток печени или селезенки легких, ти 5тичающий введение кейлонсодераащего муса мыши, в качестве агара испольэусубстрата в клеточную систему, после- ют агар, содераащий глюкозу и метиледующее внесение полученной смеси в новую синь, при этом регистрацию реагар и регистрацию результатов о т эультатов проводят по обесцвечиванию л и ч а ю щ и й с я тем, что, с це- агара.