Способ получения регенерантов подсолнечника в культуре соматических клеток

СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИ 172059 б СПУБЛИК 19) 5/04 0 А 01 Н ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ Оап 1 Ьогд О. .М 11 1 ег Й.АО) 1 ва К. йц 1 г 1 ем гесц 1 гевепсз о 1 зцзрепз 1 оп сц 1 агез о 1 зоуЬеап гоо 1 се 11 з. Ехр, Се 1. Вез., 1968, ч.50, р. 151-158.Патент Франции В 2605839,кл. А 01 Н 5/00, 1986,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕГЕНЕРАНТОВ ПОДСОЛНЕЧНИКА В КУЛЬТУРЕ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию изолированных тканей растений и может быть использовано в селекционной практике для создания новых и улучшения существующих сортов растений. Целью изобретения является повышение выхода растений-регенерантов и количества зон морфогенеза. Способ предусматривает получение из незрелых зародышей растений регенерантов путем двухэтапного культивирования на модифицированных питательных средах Мурасиге-Скуга и Гамборга В 5. плантата и оптимального Было показано влияние г ламинопурина (БАП) и 2,4 уксусной кислоты (2 эксплантатов синтети Яаппасе, а именно на лист ледонов, апексы побегов котиля. Оказалось, ч МцгазЫде апб ЯМоод в со БАП и МЯ с 2,4-Д не вызыв побегов из каллуса ни для тата, на среде МЯ с доба наблюдали регенерацию каллуса, полученного при факторов выаней и клеток кая регенерании-ре прямо огенез К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Институт общей генетики им, Н.И.Вавилова(56) Огесо ВТащагеа О.АСаггоззо 6.,В 1 апсо А. Сацз 1 пбцсбоп апб зйоосгедепега 11 оп п зцпйоаег (Неапсйцзаппццз 0 Рапт. Яс 1 .ест., 1984, ч. 36, В 1 р.73-78.МцгазЫде Т. апб ЯКоод Р. А геч 1 зебп 1 еб 1 цп 1 о 1 гар 1 б дгоай апб Ьоаззауз аЙсоЬассо 1 ззце сц 11 цге. РЬуз 1 о 1. Ращ., 1962,ч. 15, р. 473-497.Рпег 1,1. 01 гест зовас 1 с евЬг 3 одепез 1 запб рапт гедепега 1 оп Хгов 3 вваТцгееп 1 Ьгуоз о 1 ЬуЬг 1 б зцпйоччег (Не 1 апйцзаппццз .) оп а ЫдЬ зцсгозе - соп 1 а 1 ппдвебцв. Рапт. Се, Верогсз.,1987, ч,6, В 5,р. 372-374,Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию изолированных тканей растений, и может быть использовано в селекционной практике для создания новых и улучшения уже известных сортов растений.Одним из лимитирующихращивания изолированных ткподсолнечника является низция растений,Известны способы получения растегенерантов подсолнечника путем го и непрямого соматического эмбриа, основанные на подборе типа экссостава среды. ормонов 6-бензи- -дихлорфенокси,4-Д) на ряд ческого сорта ья, участки котисегменты гипото среда (МЯ) четании с 2 4-Д и ает образования одного экспланвкой 1 мг/л БАП из глобулярного культивированиисегментов гипокотиля. Недостаток этого метода в том, что он касается только одного редкого генотипа.Известен прямой соматический эмбриогенез и регенерация растений из незрелых зародышей на среде с повышенным содержанием сахарозы. Через шесть дней начала культивирования показано образование белых соматических зародышей непосредственно из котиледона зиготических, без образования каллуса. Незрелые зародыши на 7-14-й день после опыления помещали на среды, содержащие МЗ соли; витамины среды ОагпЬог 9 з (Вв); различные концентрации сахарозы (3, бф, 12); в качестве добавок - 2,4-Д, дикамба, пиклорам, ф-индолил-уксусная кислота (ИУК), и а-нафтил-уксусная кислота (НУК). Показано, что образование соматических зародышей не происходило на средах с 3% сахарозы и использованием в качестве добавок ИУК или НУК. Оптимальными являлись среды с 6 и 12 сахарозы в сочетании с 1 мг/л 2,4-Д или 3,3 мг/л дикамба, При помещении на данные оптимальные среды зрелых зароды.- шей или тканей асептических проростков (листьев, апексов, гипокотилей) прямого соматического эмбриогенеза не наблюдалось, Недостатки этого способа в том, что он применим только к определенному типу эксплантатов, а именно к незрелым зародышам на 7-14 день после опыления (следовательно, малым гибкость), кроме того, степень регенерации полученных всходов остается еще не очень достаточной. Из известных способов наиболее близким по своей сущности является способ регенерации подсолнечника, применимый к восьми сортам подсолнечника, описывающий регенерацию из незрелых зародышей на 4 - 21-й день после опыления. Культивирование по известному способу осуществляется в три этапа, Первый этап образования эмбриогенных каллусов из клеток или тканей путем культивирования в питательной индуцирующей среде, содержащей соли и витамины МЯ, аминокислоты, 9 ф сахарозы, гормон цитокининового типа БАП в концентрации 0,5 - 1 мг/л. Второй этап - культивирование эмбриогенных каллусов для их роста, развития и прорастания в среде, содержащей соли и витамины МЯ, аминокислоты, 3; сахарозы, 0,1 - 0,5 мг/л БАП. Третий этап состоит в перенесении проростков для их роста и развития на среду, содержащую соли и витамины Вь, 1 ф 4 сахарозы, гормон ауксинового типа - ИУК в концентрации 0,1 - 0,2 мг/л,5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Недостатки этого способа состоят в необходимости осуществления изменений сред между первым, вторым и третьим этапами, что ведет к большей вероятности инфицирования, а также невысокой частоте регенерации.Целью изобретения является повышение выхода растений-регенерантов и количества зон морфогенеза,Способ предусматривает культивирование эксплантата подсолнечника в питательной индуцирующей среде, содержащей гормоны для инициации эмбриогенных каллусов и дальнейшее культивирование эмбриогенных каллусов для их роста, развития и прорастания, позволяющее получить растения-регенеранты.Использование способа приводит к множественному образованию побегов из одного зародыша путем непрямого соматического эмбриогенеза.Способ осуществляется следующим образом,Используют восемь генотипов подсолнечника: сорта Передовик, Надежный, Енисей, Ультраскороспелый, Ржаксинский; инбредную линию 36-29; две гибридные линии М 1 65/1 А х НА 234 А х К 3064.В качестве эксплантата для индукции каллуса используют незрелые зародыши на 9 - 21-й день после опыления. Изолированные в асептических условиях незрелые зародыши помещают на питательную среду МЯ с 3% сахарозы, дополненную 5 г/л КЙОз, 100 мг/л инозитола, 500 мг/л казаминовых кислот, 0,5 мг/л БАП и 5 мг/л НУК с дальнейшим получением морфогенетического каллуса, Каллусную ткань выращивают в термостате при с = 26-28 С, далее при фотопериоде 16 ч день - 8 ч ночь при 1 = 26 - 28 С с перенесением каждые 25-30 дней на свежую питательную среду. Затем после роста каллусной ткани отделенные побеги переносят на среду для корнеобразования, содержащую соли Вь, 0,5% сахарозы, 2 мг/л ИМК, 0,5 мг/л пиридоксина НС 1,П р и м е р 1. Растения подсолнечника сорта Ржаксинский выращивают в теплице в сосудах с почвой, В момент цветения каждое растение отмечают этикеткой с указанием даты цветения. На 9 - 21-й день после опыления семянки стерилизуют путем погружения на 1 мин в 50 ф(-ный этанол, далее на 10 мин в 9-ный раствор продажного хлорамина Б, затем промывают трижды стерильной дистиллированной водой. Изолированные в асептических условиях зародыши размером 0,1 - 0,8 см помещают на среду, содержащую соли и витамины МЯ,1720596 Аналогично проводят испытания с другими генотипами подсолнечника.Предлагаемый способ ускорил в 1,2 раза по сравнению с известным процесс образования зон морфогенеза и зачатков побегов путем непрямого соматического эмбриогенеза. Через 12-14 дней наблюдали образование зон морфогенеэа и зачатков побегов на индуцирующей питательной среде. Повысилась частота образования морфогенетических линий в 1,5 раза, увеличилось число множественных зон морфогенеэа в 4-6 раз.Предлагаемый способ позволит получить регенерацию подсолнечника путем непрямого соматического эмбриогенеза,45 50 Составитель А.Гопоненко Редактор Н.Лазаренко Техред М.Моргентал Корректор М.ШарошиЗаказ 904 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 3% сахарозы, 4 г/л КИОз, 90 мг/л инозитола, 400 мг/л казаминовых кислот, 0,4 мг/л БАП,4 мг/л НУК. В течение первых 20 дней клеточные культуры выращивают в термостате при 1 = 26-28 С, далее - при фОтопе риоде 16 ч день - 8 ч ночь при 1 = 26-284 С. Через 25-30 дней выросший каллус пересаживают на свежую питательную среду, одновременно отделяя образовавшиеся побеги и перенося их на среду для корнеоб разования, содержащую соли В 5, 0,5 саха- розы, 1 мг/л ИМК, 0,4 мг/л пиридоксин НС 1. В каждом пассаже учитывают количество полученных растений-регенерантов и образовавшихся эон морфогенеза. 15П р и м е р 2. Способ осуществляется аналогично примеру 1, различие состоит в составе питательных сред для индукции каллуса и корнеобразования. Питательная индуцирующая среда содержит соли и вита минц МЯ, Зосахарозц, 5 г/л КИОз, 100 мг/л инозитола, 500 мг/л казаминовых кислот, 0,5 мг/л БАП, 5 мг/л НУК. Вторая среда содержит соли В 5, 0,5% сахарозы, 2 мг/л ИМК, 0,5 мг/л пиридоксина НС 1, 25П р и м е р 3. В среду для индукции каллуса, содержащую соли и витамины МЗ, 3% сахарозы, добавляют 6 г/л КМОз, 110 мг/л инозитола, 600 мг/л казаминовых кислот, 0,6 мг/л БАП и 6 мг/л НУК. Среду для 30 корнеобразования, содержащую соли В 5, 0,5 Осахарозы дополняют Змг/л ИМК и 0,6 мг/л пиридоксин НС 1. Остальные приемы осуществляют аналогично примеру 1.П р и м е р 4, Незрелые зародыши сорта 35 Енисей, собранные на 9-21-й день после опыления, когда они достигают размеров 0,1-0,8 см, стерилизуют, изолируют в асептических условиях и далее процесс культивирования ведут по примеру 2. 40 Формула и зоб рете н ия Способ получения регенерантов подсолнечника в культуре соматических клеток, включающий зксплантацию незрелых зародышей на модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга, получение на ней морфогенетического каллуса, регенерацию побегов, перенос их на модифицированную питательную среду Гамборга В 5 для корнеобраэования и адаптацию полученных растений к условиям открытого грунта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью павы щения выхода растений-регенерантов и количества зон морфогенеэа, получение каллуса и регенерацию побегов осуществляют в один этап с добавлением в питательную среду 4000-6000 мг/л нитрата калия, 90 - 110 мг/л инозитола, 400-600 мг/л казаминовых кислот, 0,4-0,6 мг/л 6-бензиламинопурина, 4-6 мг/л а-нафтилуксусной кислоты и корнеобразование проводят в присутствии 1-3 мг/л индолилмасляной кислоты, 0,4 - 0,6 мг/л пиридоксина НС 1,