Способ регенерации растений подсолнечника

СОКэ СОВЕ тг;КИХСОЦИАЛИСТ ИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 27514 А судАРстВенный кОмитет ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИ ГКНТ СССР(56) тгесо В, ет. а 1. СаИОз 1 иге 9 епегатОп 1 п зцпйоччег(НР 1 апт зс 1 епез 1 еттегз, ч,36,Ратегзоп,Каго Е:ЯЬоотНе 11 аптцз аппоз, - Апт 1. В1983, р.881.Езр 1 паззе А. ет.а 1.: 1=асч 1 тго дече 1 орпепт О 1 Яопэ 9 гопоп 1 е, 1985, ч 5, М 9,Изобретение относится к биотехнологии, в частности к выращиванию растений 1 пч 1 тго, более конкретно оно.относится к способу регенерации растений подсолнечникаиэ незрелых зародышей путем саматического эмбриогенеза,Известей ряд работ по регенерастений подсолнечника . Так, известучение регенерантов из сегментов слей и гипотиля, апексов побегов,Недостатком данного способа являетсяневысокий выход регенератив при высокойтрудоемкости культивированияИзвестен также способ регенерации побегов подсолнечника из незрелых зародышей. цс А 01 Н 4/00, С 125(54) СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА(57) Изобретение относится к биотехоло гии, в частности к выращиванию растении и ЧТГО, а бОЛЕЕ КОНКрЕтНО К СПОСОбу регоно 1 а ции растений подсолнечника из незрелых зародышей путем соматического змбриог неза, Целью изобретения является поцци ние выхода регенерантов, а ажп повышение частоты образования зон эм 1 рио- и морфогенеээ. Способ предусмэтрй вает получение из незрелых зародыпей соматических эмбриоидов и последуощу регенерацию из них побегов нэ модиии рованных средах Мурасиге-Скуга и ла 11. нейшее корнеобразование н модифицированной среде Гамборга В Способ позволяет получить массовую Ге 1. нерацию растений подсолнечника. 3 з г.ф лы, 1 табл,Одн стабиль (Л рантов.ю 3Известен способ получения рт;1 Г".)1 ф тов подсолнечника из незр л,х эрод.11 и путем их предварительной эксплата 11 и и получения из них фертил,1 х растений.Однако данный способ не поэволяе получить массовую рее,)а 11 о рас еии ввиду низкого коэффици. та азможтия при использовании данного метода.Цель изобретения" г 1 т 1,1 о 11 в тт,холл регенерантов, э также г 11,1 еие частоты образования эон эмбрио. Я 1 гнеза.ако данный способ не обеспечива 1 ного получения растеий-рог 1.10 Поставленная цель достигается путем использования трех последовательных этапов: первый этап образования эмбриогенных каллусов из клеток или тканей путем культивирования в питательной индуцирующей среде, содержащей гормон; второй этап культивирования эмбриогенных каллусов для их роста, из развития и их прорастания в среде, содержащей гормон; в известных случаях, третий этап, состоящий в культивировании, позволяющем осуществлять рост и развитие растений; два первых этапа осуществляют в среде одной и той же природы и эта среда содержит гормон питокининового типа без гармона ауксина.Растительные ткани, откуда можно извлекать эксплантаты для продуцирования соматических зародышей, происходят из культиваторов подсолнечника Не 11 ап 1 Ьоз апп 0 цз, используемых главным образом в программах селекции. В качестве примера использовали 8 культиваторов (сортов), НА 89, НА 290, НА 291, НА 300, НА 303, Т 76, РТ 26 и 6 апт бгау зтгре Сорт НА 89 происходит от Оабе Соцмз Флорида, сорта НА 290, НА 291, НА 300, НА 303, Т 76, и РТ 26 происходят от Ясейесптегпабопа 11 Ьс Калифорния, и Оапек (Згау зтг 1 ребе погйгОр Кпб зеебз Калифорния,Эксплантаты происходят от растений, культивируемых в теплице и подвергнуты контролированному оплодотворению. Предпочтительным эксплантатом для продуцирования каллуса является недоразвитый зародыш. Недоразвитые зародыши с околоплодниками выделяют из головок подсолнечника, когда они имеют возраст 4 - 21 день, их размер обычно составляет 0,.1 - 5 мм. Недоразвитые зародыши значительного размера могут быть разрезаны на несколько равных частей согласно плоскости, проходящей по оси перышка зародышевого корешка, что размножает число клонов, полученных иэ одного зародыша.Способ согласно изобретению осуществляется следующим образом.Сорта подсолнечника НА 89, НА 290, НА 291, НА 300, НА 303, Т 76, РТ 26 и 0 апт Огау Заре культивируют в теплице (26 С, 40 ООО лк, фотопериод 15 ч в 1 день) и подвергают контролируемому оплодотворению, Недоразвитые зародыши извлекают спустя 4 - 21 день после опыления. Отделенные от головок зерно стерилизуют путем погружения на 20 мин в раствор жавелевой воды с 3 С 1, в который добавлено. несколько капель смачивателя, затем промывают 3 раза стерильной ристиллированной водой. Зародыши затеи изолируютв асептических условиях, в известных случаях разрезают и помещают 20 25 30 35 40 45 50 55 в первую среду - среду индукции зародышей,Эта первая среда включает минеральные соли, витамины, аминокислоты, сахароэу и гормон в количестве, достаточном для образования каллуса, Минеральные соли включают соли макроэлементов и соли олигоэлементов, Макроэлементы, используемые в этой первой среде, могут быть выбраны, например, среди следующих соединений: сульфат магния, хлорид кальция, монофосфат калия, нитрат калия и нитрат аммония. Из солей на основе олигоэлементов можно назвать: борная кислота, сульфат марганца, сульфат цинка, молибдан натрия,сульфат меди ( ),хлорид кобальта; иодид калия и хелат железа-йа-ЭЛТК, Эта комбинация минеральных солей известна под названием МогазЫ 9 е ц ЯКооц (МЯ),Предпочтительные количества макроэлементов и олигозлементов на.1 л средыследующие, мг: 370 гептагидратированныйсульфат магния, 440 дигидратированныйхлорид кальция, 170 дигидративный моносульфат калия, 1900 нитрат калия, 1650 нитрат аммония, 6,2 барная кислота, 22,3тетрагидратированный сульфат марганца,8,6 гептагидратированный сульфат цинка,0,25 дигидратированный молибдат натрия,0,025 пентагидратированный сульфат меди(1 ), 0,025 гексагидратированный хлорид кобальта, 0,83 иодид калия, 36,7 хелат железоИа-ЭТЛК,Первая среда содержит также витамины, такие как никотиновая кислота, тиамин,пиридоксин, мио-инозитол. и аминокислоту,такую как аланин, глутамин, серин, триптофан, цистеин и предпочтительно глицин,Предпочтительными количествами витаминов и аминокислот на 1 л среды являются,мг: 0,5 никотиновая кислота, 0,1 хлоргидраттиамина, 0,5 хлоргидрат пиридоксина, 100мио-инозитола, 2 глицина.Первая среда также может содержатьдобавку витамина и аминокислот. Эта добавка не является необходимой для образования соматических зародышей, но онаувеличивает их частоту. 8 этом случае предпочтительными количествами витаминов иаминокслот на 1 л среды являются, мг: 0,5никотиновая кислота, 0,1 хлоргидрат тиамина, 0,5 хлоргидрат пиридоксина, 4000 миониозитол, 1000 1-аланин. 800 1-глутамин,160 1-серин, 50 триптофан, 10 1-цистеин; 2глицин,Сахароза, содержащаяся в первой среде, имеется в количестве 8 - 1200, и редпочтительно 9%.Гормон первой среды, выбор которого"является характеристикой изобретения -172754,10 15 30 35 45 50 55 питсининового типа, например кинетин или б-бензиламинопурин, и предпочтительно последний. Обычно пригодны количества 0,5-.1 мг на 1 л среды. Агар, Р)тутацаг или Оегде используется для создания твердой 5среды. Конечная концентрация 0,6% для Р)тусацаг или 0,3% для Ое)гте дает хорошие результаты, рН-значение среды может меняться от 5,0 до 6,3 в предпочтительно составляет 5,0.Среду стерилизуют в автоклаве за исключением гормонов, которые стерилизуют путем фильтрации через микропористую мембрану,Недоразвитые зародыши, выделенные как описано выше, помещают в эту первую среду, культивируют в течение около 2 - 3 недель в темноте при 26 С, В течение этого периода зиготические зародыши развиваются и соматические зародыши появляются 20 на уровне гипокотиля и на внутренней поверхности семядолей в случае культивара(сорта) ПА 291. Затем соматические зародыши могут быть изолированы и помещены во вторую среду - среду роста проростков. Эмбриогенный каллус или выделенные зародыши культивируют во второй среде в течение 2- 8 недель при 26 С и на свету(1500 лк) с фотопериодом 12-16 ч в 1 день, предпочтительно 16 ч в 1 день. В течение этого периода зародыши прорастают и образовавшиеся ростки развивают в известных случаях. корни.Вторая среда, как и первая, содержит минеральные соли, витамины. аминокислоту, сахарозу и гормон, Минеральные соли включают соли макроэлементов и соли олигоэлементов, Макроэлементы, олигоэлементы, витамины и аминокислота те же, чтои в первой среде, и идентичных концентрациях без добавлений. Сахароза имеется в количестве предпочтительно ниже такого первой среды, нап ример 2-4%, и редпочтительно 3%,Используемым гормоном является цитонинин, предпочтительно идентичный или отличный от первой среды, предпочтительно 6-бензиламинопурин. Обычно пригодны количества 0,1 - 0,5 мг на лист. Агар РЬутацаг или Оег)те используется для создания твердой среды. Конечная концентрация 0,6% для РЬу 1 ацаг и 0,3% для Оегте дает хорошие результаты. Среду стерилизуют.как и ранее, рН среды 5,0 - 6,8, предпочтительно рН 5,0,Спустя 2-5 недели пребывания во второй среде, выделенные соматические зародыши прорастают и превращаются в ростки 2-5 см. Ростки, которые развили корни, могут быть высажены в землю, стерильную смесь торфа,нермикулитэ,тонкодисперсно. го песка (3:2:1), содержащуюся в горшках .)ЬЫ. Горшки помещаю 1 в бак,.заполненный влажныл 1 песком, и покрывают про трач ным полиэтиленовым пакетом для поддержания высокой степени влажности, Всю совокупность помещают в климатическую камеру с температурой 15 С (6000 лк) с фотопериодом 12 - 16 ч в 1 день, предпочтительно 15 ч в 1 день. Спустя 10 дней растения помещают в более крупные горшки и культивируют в теплице при 26 С (40000 л к) с фотопериодом 12 - 16 ч в 1 день, предпочтительно 15 ч в 1 день.Растения, которые не развили корней, могут быть привиты кмолодым растениям, культивируемым в теплице, согласно классическому методу либо помещены на период 10 - 20 дней в среду для укоренения или в третью среду.Третья среда включает минеральные со. ли, витамины и сахарозу. Минеральные соли включают соли макроэлементов и соли олигоэлементов. Используемые в этой третьей среде макроэлементы могут быть выбрань 1 среди следующих соединений сульфат ма- ния, хлорид кальция, мононатрийфосфлт, нитрат калия и сульфат аммония. Среди еп лей на основе олигоэлементов можно на звать борную кислоту, сульфат марганца, сульфат цинка, молибдат натрия, сульфа меди , хлорид кобальта, иодид калия и хелат Ге-Иа-ЭТЛК. Эта комбинация мине ральных.солей известная под названием Б 5, Предпочтительные количества макроэле ментов и олигоэлементов на 1 литр среды следующие мг,; 250 гептагидратированный сульфат магния, 150 дигидратированный хлорид кальция, 169 моногидратированный мононатрийфосфат, 3000 нитрат калия, 3 борная кислота, 13,2 тетрагидратированный сульфат марганца, 2. гептагидратированный сульфат цинка, 0,25 дигидратированный молибдат натрия, 0,025 пентагидратированный сульфат меди , 0,025 гексагидратированный хлорид кобальта, 0,75 иодид калия, 40 хелата Ре-Ма ЭДТК.Третья среда также содержит витамин ьк Это никотиновая кислота, тиамин, пиридоксин, и мио-инозитол. Предпочтительными ко личествами витаминов на 1 л среды являются, мг: 1 никотиновой кислоты, 10 хлоргидрата тиамина, 1 хлоргидрата пиридоксина и 100мио-инозитола,Третья среда содержит также сахарозуи активированный уголь и/или гормон аук. синового типа. Сахароза имеется, например, в количестве 1-2%. предпочтительно 1%, а активированный уголь в количестве0.1, Если испольэовать гормон вместо активированного угля, то выбирают 3-индолуксусную кислоту в дозах 0,1-0,2 мг на 1 л.Агар Рьуадаг или Ое 1 гте, используют длясоздания твердой среды . Конечная концентрация 0,5 ф для РЬутадаг и 0,25, дляОе)г 1 те достаточная. рН среды может изменяться от 5,0 до 6,0 и предпочтительно составлять 5,0. Среду стерилизуют в. автоклаве.Растения культивируют в этой среде втечение.2-3 недель при 26 фС на свету (1500лк) с фотопериодом 12-16 в 1 день, предпочтительно 16 ч в 1 день. Растения образуюткорни и могут быть высажены в землю.Полученные этим способом растениямогут быть фенотипически отличными от исходного материала вследствие стресса инвитро. Растения опыляют вручную и выдерживаются вплоть до сбора семян, Несколько единиц зерен сажаютдля анализа новыхрастений подсолнечника и селекции возможных интересных мутантов, которых затем вовлекают в программу селекцииразновидностей;П р и м е р 1, Приготовление маточныхрастворова, Маточный раствор В 5. Маточный раствор В 5, концентрированный десятикратно,готовят растворением пакетика со средойВ 5 без сахарозы Е 1 ов аЬогатогез (содержит минеральные соли 85; 1 мг никотиновойкислоты, 1 мг пиридиксина - Н 01, 10 млтриамина. НО и 100 мг иноэитола, в конечных концентрациях) в 100 мл (конечный объем) дистиллированной е деионизированнойводы, Маточный раствор разделяют на аликвоты по 100 мл и хранят при -20 С.б. Маточный раствор ВАР. Раствор ВАРс 1 г/л готовят путем растворения 100, мг6-бензиламинопурина в нескольких мл 0,15и НС 1, слегка нагревая. и разбавления 160мл дИстиллированной и деионизированнойводы. Этот. раствор стерилизуют фильтрацией через мембрану М 1 п 1 загс ММ 1.0,2 микрона (ЗагтогЬз) перед его добавлением кпервойи второй средам.в, Маточный раствор А 1 А, Раствор А 1 Ас 0,2 г/л готовят растворением 20 мг 3-индол-уксусной кислоты в нескольких миллиметрах чистого этанола и разбавлением 100мл дистиллированной и деионизированнойводы. Этот раствор стерилизуют фильтрацией через мембрану Мп 1 заг йМ 0,2 мкм(Залогцз) перед добавлением к третьейсреде.г. Добавка витамина и аминокислот согласйо СЬапб 1 ег и ВЕАЙО,Исходный раствор витамина и аминокислот, двадцатикратно концентрирован. нйй, готовят растворением совокупности 30г мио-инозетола 10 г 1:аланина, 8 г 1:глутамина, 1,6 г 1:серина, 0,5 1:триптофана и 0,1г 1:цистеина в 500 мл (конечный объем) дис 5 тиллированной и деионизированной воды,Исходный раствор разделяют на аликвотн це части по 50 мл и хранят при -20 С .П р и и: е р 2. Приготовление сред,а, Первая среда или среда индукции за 10 родышей. Среду готовят растворением пектина со средой МцгазЬ 1 де и 31 оод безсахароэы Е 1 оа ОЬогмогез, содержит минеральные соли МЗ 0,1 мг тиамина, НО 0,5 мгпикотиновой кислоты, 0,5 мг пиридоксина.15 НС 1, 2 мг глицина и 100 мг инозитола и90-120 г сахарозы в дистиллированной идеионизированной воде. После возможногодобавления 50 мл добавки витамина и ами: нокислот, рН доводят до 5,0 с помощью 0,120 н. раствора гидроксида натрия, объем доводят до 1 л и после добавления 6. г РЬутадаг(С 1 Ьсо) или 3 г бегте(Кесо) смесь выдерживают в автоклаве в течении 20 мин при 120рз 1. Когда смесь остыла, в нее добавляют25 0,5 - 1 мл раствора ВАР (2,2-4,4 мкмоль), стерилизованного, как описано выше; Смесьзатем выливают в чашки Петри,б. Вторая среда или среда роста проростков. Вторую среду готовят идентичным30 первой среде образом. растворяя совокупность пакетика со средой М, 30 г сахарозци 6 г РЬу 1 адаг или 3 г Оегте в 1 л воды,добавляют после выдерживания в автоклаве 0,1-0,5 мл стерильного раствора ВАР35 (0,44-2,2 мкмоль). Среду выливают в чашкир 1 агиеоп (Е 1 оа ЕаЬогатог 1 ез).в, Третья среда или среда укоренения.Третью среду готовят добавлением 1020 г сахарозы на 100 мл исходного раствора40 В 5, в дистиллированной и деионизированной воде. рН доводят до 5,0 с помощью 0,1 н,раствора гидроксида натрия, затем обьемдоводят до 1 л и добавляют смесь 0,5 гРЬу 1 адаг и 1 г алкированного,угля. После45 прохождения автоклава, среду выливают вМазоп )агз. Если хотят использовать третьюсреду, содержащую А 1 А, то активированный уголь не употребляют во время приготовления этой третьей среды. После50 прохождения автоклава в остывшую средудобавляют 0,5-1 мл стерильного раствораА 1 А (0,57-1,14 мкмоль), Среду выливаютидентичным образом в Мазоп агз,Жидкий вариант третьей среды включа 55 ет.только минеральные соли е 5 и 1 сахароэы, при рН 5,0. Смесь распределяют нафракции по 10 мл в стеклянные трубки, содержащие мостики иэ фильтровальной бумаги, согласно способу. описанномуСНАЮ 1.ЕВ и ВЕАВО, затем выдерживают.вавтоклаве,П р и м е р 3, Недоразвитые зародышис их околоплодниками отделяют от головкиподсолнечнике (Неапйцз аппццз, разновидность Т 76 В), когда они достигают размера 0,5-1,5 мм, Зерна стерилизуют в течении20 мин в растворе кавелевой воды в с 3" Си споласкивают дистиллированной водой,Недоразвитые зародыши отделяют от ихоболочек и помещают в чашки Петри на первую среду. Первая среда получена описанным образом, с 90 г/л сахарозы и 0,5 мг/лВАР (2,2 - мкмоль),Чашки Петри инкубируюг в темноте втечение 3 недель для того, чтобы привести кобразованию соматических зародышей.В этой стадии, соматические зародыши,которые начали прорастать, отделяют от зиготического зародыша и помещают на вторую среду в чашки Рап 1 еоп, Вторая среда,приготовленная как описано выше, содержит 0,1 мг ВАР на 1 л или 0,44 мкмоль.Зародыши культивируют на свету о течение3 недель и они дифференцируются по росткам.Ростки высотой 2 - 5 см затем переносятна третью средудля инициирования образованием корней. Третья среда, приготовленная как описано выше, содержитпредпочтительно 10 г сахарозы, В случаеэастудневания среды добавка 1 г/л активированного угля удаляет остаточное влияниеВАР, осуществляемое в предыдущей средеМАЕТЕ .И ОЕВЕВОН, Рапт СЕ ТззцеОг 9 ап Сциге и благоприятствует быстромуросту корней. Спустя примерно 2 неделиростки могут быть высажены в землю,Если ростки начали развивать корни навторой среде, то они могут быть введены вконтакт с третьей жидкой средой, согласнотехнике, описанной СНИО 1 Ей и ВЕАВО.Это устройство позволяет значительно развивать корневую систему и избегать повреждения корней во время высадки вземлю.П р и м е р 4. Недоразвитые зародышиНейапйцз аппццз разновидность НА 89 отбирают, когда они достигают роста 0,1-0,5мм, с эндоспермом на первую среду. Перваясреда содержит 90 г сахарозы и 0,5 мг ВАРна 1 литр или 2,2 мкмоль. Спустя 3 недели втемноте соматические зародыши изолируют и помещают на первую свежую среду всевремя в темноте. Вторичные соматические, зародыши образовываются на изолированных зародышах. Спустя 3 чедели пребывания в темноте вторичные соматическиезародыши изолируют и помещают на вторую среду. Вторая среда содержи 30харозы и 0,1 мг на 1 л (0,44 мкмоль,Ростки, которые развиваются, злвм мо.гут быть перенесены на третью сроду д5 кую или, подвергнутую застудноглию дввукоренения, затем будут пересажены в звм.лю,П р и м е р 5. Недоразвитые зародышиНеаптЬзз аппццз, разновидность НА 89 от 10 бирают спустя 21 день после опыления, оиимекц размер 5 мм, Их отделяют от их оболочек и до внесения на первую среду разрезают на четыре равные части продольносогласно двум перпендикулярным плоско15 стям между ними и параллельным оси п.;.рышка первичного корешки. В этом слч апервая среда содержит 90 г сахарозы и 1 мгВАР на 1 л. Спустя 3 недели о темноте сол- тические зародыши изолируют и помоц;.юе20 на вторую среду.,Вторая среда содержит 30г сахароэы и 0,5 мг ВАР на 1 л,Ростки, которые развиваются, затем могут быть перенесены на третью среду жлд.кую или подвергнутую застуднеоаио) двя25 укоренения, затем высажеы в земло. Рос.тки, которые не имеют корней, могут быгприоиты к молодому растению согласно м.тоду,описанному НАВЕМАКИ и Ва .асв.П р и м е р ы 6-27. Приведенные прим30 ры дают комбинации, которые можо осущестолять, используя различные освнпримеры,Предлагаемый способ позволяет полу итмассовую регенерацию растений под 35 солнечника из незрелых зародышей. путолсоматического эмбриогенеза.В таблице представлены результаты исследований действия способа на разливыхлиниях подсолнечника.40 Формула изобретен ил 1. Способ регенерации растений подсолнечника, включающий три последоотельных этапа, при этом пероый эт е 45 предусматривает получение из эксплантовэмбриогенных каллусов и соматических эл бриоидов с последующим их ростом а мо.дифицированной питательной среде Мурасиге - Скуга, второй этап - формлровв ние проростков и развитие их о расееиямодифицированной питательной среде Мурэсиге - Скуга и третий этап - формирование и рост корней у полученных растений а питательной среде, содержащей источники 55 азота, фосфора, калия, углерода, млкроэлементы, витамины и стимуляторы роста, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода регенерантов, о качестве эксплантов используют незрелые зародыши в возрасте от 4 до 21 дня размером 0,1-5 мм.,5 мв 3 О,ви гау гг еркит 600 м а аммония и" Модимицилоеамная среднитрата калия, 00 мкзлементы остаются неиДополнгнизв средасреда 111 актнвировен МВ со нитра некиим ыд уго 260 игидратироеанного хлорида кальция, 0 мг иио-ниознтола нал среды, др ги- твердая срь МЬ - мидка АА (О,или 0,2 нг/л); 1115реда 111. ерла Составитель с 5.Демкинедактор М,Недолукенко Техред М,Моргентал Кор ктор Л.Патай Заказ 1283 ВНИИПИ писноеоткрытиям при ГКН 1 СССР, 4/5УЖГОРОД, Уп 1 а;)т) 11 Тираж Под Государственного комитета по изобретениям и 113035, Москва, Ж, Раушская наб, Произ ий комбинат " тент одсгвенно издлте первый этап осуществляот на питательной среде в присутствии 2,2-4,4 моль/л 6-бензиламинопурина, 0,5 мг/л никотиновой кислоты, 0,1 мг/л хлоргидрата тиамина, 0,5 мг/л хлоргидрата пиридоксина, 100 мг/л миоинозитола, 2 мг/л глицина,при содержании сахарозы 9-12%, второй этап осуществляют в присутствии 0,44 - 4,4 ммоль/л 6-бензиламинопурина, 0,5 мг/л никотиновой кислоты, 0,1 мг/л хлоргидрата тиамина, О 5 мг/л хлоргидрата пиридоксина, 100 мг/л миокнозитола, 2 мг/л глицина, при содержании сахарозы 30/7, третий этап осуществляют на 1 мг/л модифицированной никотиновой кислоты, 10 мг/л хлоргидрата тиамина, 1 мг/л хлоргидрата пиридоксина, 100 мг/л миоинозитола, 0,1-0,2 мг/л индолил-уксусной кислоты, при содержании сахарозы 1 - 27 ь, при этом после второго этапа полученные растения прививаот,2 Сгособ по п.1, ) т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цель)о повышения частоты образования зон эмбриоморфо генеза, на первом этапе в питательную сре ду дополнительно вносят 3900 мг/лмиоинозитола. 1000 мг/л Е-аланида, 160 мг/л 1:серина, 800 мг/л Е-глутамина, 50 мг/л 1:триптофана, 10 мг/л 1 -цистеина,3. Способ по пп, 1 и 2, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что используют линии подсолнечника Т 76, РТ 26, НА 89, НА 291, 6)ап 1 Огау.Зтг пе.4. Способ по пп.1-3, о тли ч а ю щи йс я тем, что после второго этапа растения, 15 имеющие корни, высаживают в землю и инкубируют в климатической камере при 15 С,.интенсивности освещения 6000 лк с 15-часовым фотопериодом.