Способ регенерации растений люцерны из клеток

. ,6 ь Оманал0 П И А-"И ЗОЬРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ п 1,721 О 36 Союз СоветскихСоциалистическихРеспублнк(51)М. Кд. А 01 Н 3/00 с присоединением заявки МЬеудеретвеай кемтет СССР вв аеам зебрете н етхрмтДата опубликования описания 17.03.80(72) Автор изобретения А В Мезенцев Всесоюзный ордейа Трудового Красного Знамени научноисследовательский институт кормов им. В. Р. Вильямса(54) СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ ЛЮЦЕРНЫИЗ КЛЕТОК Изобретение относится к сельскомухозяйству и может быть использовано вселекции и семеноводстве растений, вчастности в селекции на клеточном уровне и для. ускоренного размножения и3оздоровления селекционного материала,а также возделываемых сортов и гибридов люцерны, в исследованиях по фитопатологии, физиологии и генетике ра.тени й.оИзвестен способ регенерации растенийлюцерны из клеток суспенэионных культур, которые получают из каллусов, образовашихся из завязей, Регенерациююрастений осуществляют с использованиемпитательной среды, в которую введендрожжевой экстракт - компонент неопределенного химического составами,11,Недостатком этого способа являетсято, что регенерация растений возможналишь при наличии цветущих форм, завязикоторых служат исходным материалом дляполучения каллусов и суспеяэиойных Куль.тур клеток. Таким образом, данный способ не применим в работе с растениями, находящимися в более ранней фазе развития, нецветущими гаплоидами и мутан- тами. Минимальный срок, необходимый для получения регенерантов этим способом, очень длителен и составляет не менее пяти месяцев. К тому же введение в питательную среду компонента неопределенного химического состава (дрожжевой экстракт) затрудняет воспроизводимость результатов.Известен также способ регенерации растений люцерны из каллусов листового происхождения на агазированных питательных средах 23. Однако этот способ не применим в селекции на клеточном уровне и не позволяет получать большое число регенерантов в расчете на 1 каллус (в среднем получают 10 растений на 1 каллус).Целью изобретения является ускорение процесса регенерации растений люцерны иэ клеток с использованием питательной среды определенного хнмичес3кого состава и одновременное оздоровление исходного материала от бактериальной, грибной и вирусной инфекции.Поставленная цель достигается "тем1что в качестве агаризованной питательной среды используют агаризованнуюсреду Гамборга Ь- с повышенным содержанием железа ( Ц ) сернокислогои трилона 6 , после образования каллусов последние помещают в жидкую средуГамбо гамборга 65, в которую. в качествефитогормонов вводят 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту и бензиламинопурин, аполученные суспензии клеток переносятв Жидкую среду Гамборга 65 без фитогормонов и пересажйвают образовавшиесяиз клеток эмбриоиды на агаризованнуюсреду Гамборга Б без гормонов.Способ осуществляется следующимобразом,(Лиисточки, т.е. пластинки тройчатоголиста, культивируемых сортов и гибри-дов люцерны стерилизуют в 0,1%-номводном растворе диоцида и после трехкратной промывки в стерильной дистиллированной воде делают на каждом из нихряд надрезов по всей плошади пластинкии помещают на основную питательнуюсреду Гамборга 55, в которую дополнительно вводят 6000-8000 мг/лбактоагара и 200-300 мг/л нитратааммония,: содержание сахарозы увели.чивают до 25000-35000 мг/л, железа ( Й ) сернокислого ГеЗО Н 0 д7до0-100 мг/л, трилона Б до 90-130 мг/ли вносят следующие фитогормоны: 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д)8-16 мг/л, кинетин 6-10 мг/л ис -нафтилуксусную кислоту (НУК)0,1-0,5 мг/л, рН среды доводят до5,8-6,0. Состав среды йредставлен йиже.М акроэлементы Содержание,мг/л.К Воз 2500йаН ъ РО ИяО 150(Й Н 4) 304 134мцЗо, й,о250СскСЮ 2 Н 0 150Ге 50 РНО 28Трилон Б .37МикроэлементымЮНО1-1 ВОЕ.о 504 7 Н 20йа.Мо 04 210СзСС 2 6 НОКХ ЦитаминыНикотиновая кислота 1Ти амин-НС Ю 10Пиридоксин-НС Р 15Миоинозит 100Сахароза 20000рН среды 5,5Материал инкубируют 2-3 неделипри непрерывном освещении люминесцен 1 О тными .лампами (освещенность 0,54,0 тыс. лк), температуре 261 о С иотносительной влажности 95-100% в закрытых прозрачных сосудах.В случае появления на листочках бак 15 териальной или грибной инфекции ихудаляют с частью прилегающей к нимпитательной среды, вирусная инфекцияустраняется под воздействием фитогормонов.20 Через 2-3 недели развившиеся каллусы переносят на ту же питательную среду, но без бактоагара, нитрата аммония,кинетина и НУК, содержание железа 1125 28 исернокислого и трилона Б уменьшаю т до8 и 37 мг/л соответственно (т.е как всредеВ 5 ), содержание 2,4-Д уменьшают до 0,1-0,2 мг/л и вводят дополнительно фитогормон - бензиламино( ) 0,1-0,2 мг/л. Материал инку 30 би ют 1-2ру 1-2 недели в закрытых прозрачных сосудах на встряхивающих аппаратах с числом колебаний 100-125 мин,йри тех же параметрах освещенности,температуры и влажности, которыед используют при инкубации листочков. Образовашиеся суспензии клеток субкультичвируют каждые две недели путем добавления к 4-6 объемам свежей среды тогоже состава 1 объема суспензии.40 ъчя получения регенерантов к 4-6объемам свежей среды того же состава,но без фитогормонов добавляют 1 объемсуспензии клеток и инкубируют в техже условиях,.45 ЧЧерез 1-2 недели образовавшиесяиз клеток зеленые эмбриоиды (соматические зародыши) переносят на агаризовайную среду Гамборга В 5 без гормонов. Условия инкубации остаются прежЯ ни иними, но длину фотопериоца сокращаютдо .16 ч "в 1 сут. По мере развитиярастений на этой среде и появления уних двух-трех тройчатых листьев и корней их пересаживают в почву и выращи 55 вают в обычных условиях. Раб боту, свазанную со стерилизациейлистьев, субкультивированием суспензий25 40 2. Авторское свидетельство СССР 55 по заявке Мо 2465483/30-15,кл. А 01 Н 3/00) 1977 (прототип). Тираж 723 Подписное Филиал ППП фПатентф, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 5 7210и пересадкой эмбриоидов, проводят васептических условиях." П р и м е р. Проводилась регенерация растений из клеток суспензионныхкультур синей люцерйы сортов Рамблер,5Зайкевича и желтой сорта Дединовская.При этом были получены следующие результаты: 96% листочков, помещенныхна питательную среду с тремя фитогормонами, образовывали через 2-3 неделикаллусы. Последние помещали в жидкуюпитательную среду с 0,1-0,2 мг/л БАПи 0,1-0,2 мг/л 2,4-Д и инкубировали на.аппарате АВУ(аппарат универсальныйдпя встряхивания жидкости в колбах и 11пробирках) при 100-125 колебанийв 1 мин и амплитуде колебаний 2030 мм. В течение 1-2 недель из каллусов образовывалась суспензия клеток,содержащая более 100 тыс. клеток в 2 о1 мл. Полученную суспензию субкультивировали каждые две недели путем добавления к.4-6 объемам свежей средытого же состава 1 объема суспензии.Для регенерации растений из клетоксуспензионных культур к 4-6 объемамсвежей среды без гормонов добавляли1 объем суспензии. Через 1-2 неделииз клеток суспензионных культур образовывались хорошо развитые зеленые 30эмбриоиды (в среднем 200 эмбриоидовв 1 мл), которые пересаживали на агаризованную среду без гормонов. Через2-3 недели из эмбриоидов развивалисьрастения с 2-3 тройчатыми листьями зБи корнями. Последние пересаживали впочву и выращивали в обычных условиях,.свободны от фитопатогенной инфекции.Весь процесс от получения каллусов дорегенерации растений занимал в среднемдва месяца. Выход, регенерантов . в расчете на 1 каллус, без субкультивированиясуспензии, составлял в среднем 25 тыс. 4растений, при трехкратном субкультивированни - 625 тыс. растений,Использование изобретения позволяетзначительно ускорить процесс размножения и оздоровления люцерны за счет ускорения процесса регенерации растенийиз клеток суспензионных культур, а также расширить исходный материал, используемый в селекции на клеточномуровне за счет нецветущих гаплоидов имутантов. В селекционно-семеноводчесЦНИИПИ Заказ 2/1 36 бкой работе с люцерной этот способ позволяет значительно сокрптить выведение и испытаниеновьк сортов и гибридов, а также расширить посевы этой ценной кормовой культуры.Формула изобретения1. Способ регенерации растений люцерны из клеток, включающий получение каллусов на агаризованной питательной среде с последующей пересадкой их на питательные среды, выращивание суспензий клеток с последующим получением из них почек, эмбриоидов и растений, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения процесса регенерации растений и оздоровления их, в качестве агаризованной питательной среды используют агаризованную среду Гамборга 0 с повышенным содержанием железа ( Й ) сернокислого и трилона Б, после образования каллусов последние помещают в жидкую среду Гамборга В, в которую в качестве фитогормонов вводят 2,4- -дихлорфеноксиуксусную кислоту и бензиламинопурин, а полученные суспензии клеток переносят в жидкую среду Гамборга Вбез фитогормонов и пересаживают образовашиеся из клеток эмбриопды на агаризованную среду Гамборга В 5 без гормонов.2. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что содержание железа О сернокислого ( Ге 50 д 7 НО ) в среде Гамборга Вб составляет 70- 100 мг/л, а трилона Б 90-130 мг/л,3. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что.2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту и бензиламинопурин вводят в жидкую среду Гамборга В, в количестве 0,1-0,2 мг/л.4. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что суспензии клеток переносят в жидкую среду Гамборга В без фитогормонов в соотношении объемов 1;4-6. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе