Способ диагностики ревматизма

(54 (57 МАТИЗЕНА.к медицин скоп диагзобретеп ч нос ние и упрощеревматизма.ер ревматизмцитов Д 8/17отоксическол е спосо являетсяба циагнокения целиантиген В к Для достиа - аллоки мар лф выявля микролимфоци о не требует ния и реакти время диагнтесте,его оборудот и сокращадоро гостояцов, упрощаестики. а Ю ин особам диагностики ре Целью изобретен ние и упрощение сп ревматизма. Способ осуществматиз коре являе ба д ся у гцос икоб тся,след аз сследования и убитальной ве ют Кровь для и венепункцией к честве 20,0 мл лянта использ 300 МЕ, Кровь соотношении 1, осторожно цасл петкой на 3,3 цтикоагухтер"й 199 в В качествеуют гепарин "Р во Ьлакосредо яедецц астеро разводят ,6. Раз аивают л .ч ",цн;, плотно с миц при мецают вПетрит 50 мгця .з - клсацолцяютт 150,0 млэате тел ю кровь ской и ГраЛце 0 - 1,3, центб.,мин л - я Р р 1 тью 1, 1500 о пипетк вого градиентрифугируют 25 (350 8) . Паст оц с тонровско ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР РСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) 2-й Московский государственныймедицинский институт им. Н.И.Пирогова(5.6) А,К.К 1 апа, Л,Г 2.Ъойясу,В.К.ВцяЕ 1 Ф ег а 1. Сепег 1 с ягц 1 гея ыРЬецпаг 1 с Гечег: 1 Ргеяепсе оГ а пеНЬА. В-се 11 а 11 оапг 1 доп 1 п ргоЬапдяапд Гапа 1 гея ая пеГ 1 пед Ьу а шопос 1 о -па 1 аг 1 Ъос 1 у. Лггг 1 г 1 я Рццпс 1 аг 1 ойап 1 Н 1 М Гоцпдаг 1 оп, 1986, р, 5-8,Изобретение относитсямедв частности к иммунологическим СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РЕ Изобретение относится тности к иммунологиче ке ревматизма. Цельюким концом 1 отсасывают" беловатое"облачко" лимоцитов в пробирку сосредой 199, тщательно ресуспендируют юн отмывают средой 199 путем центрифугирования при 1500 об/мин (350 д) втечение 9 мин. Далее разделяют клеткив колонках с нейлоновой ватой с предварительной подготовкой среды и колонок для разделения ллоцтов.К 50,0 мл среды 199 прибавляют 2,0 мл.инактнвированной эмбриональной телячеи сыворотки, перемешивают не стеклянной палочкой и по термостат при 37 С. В чашке одцораэовыл иглал волокня нР: .оевой Ваты для в .",с"н ток. Колонку ца /3 рыхло э нейлоновой ватой и промываю физиологического раствора, 1707542.лой средой 199. Промытую колонку помещают в горизонтальном положении в увлажненной чашке Петри в термостат при температуре 37,4 С. Лимфоцить, отмытые средой 199, разводят в 1, мл нагретой до 37,4 С среды (199 + ЭТС). Суспензию лимфоцитов по каплям прибав,ляют в колонку, которую непосредствен:но перед введением клеток промывают 10 ,2,0 мл теплой среды (119 + ЭТС), Ко,лонку помещают в термостат на увлажненной чашке Петри на 30 мин прио37,4 С. После инкубирования ставят колонку вертикально и промывают последо 15 вательно над 6 пробирками, прокапь- вают через колонку над каждой пробиркой около 8,0 мл среды (199 + ЭТС). При промывании колонки над пробирками 1 и 2 производят энергичное "встряхи 1ванне , а начиная с пробирки 3 - осторожные возвратно-поступательные дви,жения, не касаясь верхнего слоя ваты.1 Над пробирками 5 и 6 выдавливают всю 1 жидкость из колонки, отжимая вату. 25 В пробирках 5 и 6 собираются В-клетки. Лимфоциты из пробирок 5 и 6 отмывают 2 раза путем центрифугирования пр 1 1500 об/гин (350 е) в тс.чение 10 мин, затем тщательно ресуспендируют, дово дя до концентрации 1,5 х 1 клеток в 1,0 мл, и используют для постановки микролимфоцитотоксического теста, В микрокамеру под вазелиновое масло, которое используется в количестве0,005 мл в каждотестовой. лунке в качестве покрытия для предотвращенияиспарения небольшого ксличества реагентов, последовательно раскапываютмикрошприцом типа Гамильтон: 1 - моно.цклональные антитела Д 817 в количестве 0,001 мл в центр опьггных лунок(всего использовали 6 лунок микрокамеры: Э первые контрольные, 3 опьггные) 2 - В-лимфоциты, полученные после разделения на колонках с нейлоновой ватой, в количестве 0,001 млВносят в каждую тестовую лунку(3 контрольные и Э опытные). Тщательно перемешивают в опытных лунках моноклональные антитела Д 817 с В-клетками. Затем микрокамеры инкубируют10 мин при тегпературе +4 о С. После1 якубации в каждую л,1 ку закапываюте"нэ мл свежераэморожсннога комч.еиента и помегают в термостат на25 мин при температуре 37 С. Затемв каждую лунку добавляют по 0,003 млэознна для окрашивання. Через 2 мин закапывают по 0,005 ил нейтрального формалина для фиксации реакции. Учет реакц проводят на инвертированном микроскопе МБИи выражают в процентах. Подсчитывают число погибших клеток на 10 клеток в каждой лунке. Разница между процентом погбшх клеток на 100 клеток в каждой лунке. Разница между процентом погибших клеток в контроле и опьгге является результатом теста и отражает процент В-клеток, прореагировавших с моноклональными антителани Д 8/17. Положительньв считают результат более 102.П р и м е р 1. Больной Е., 21 год. Заболел в ноябре 1988 года через 2 недели после ангины, когда появились боли и припухлость в крупных суставах. В апреле 1989 года на фоне мигрирующего артрита стал отмечать боли в области сердца и сердцебиения, в связи с чем был госпталиэирован. После полного клинико-лабораторного обследования был поставлен диагноз: ревматизм в активной Лазе. Первичньп ревмокардит, Формирующийся митральный порок сердца. Н-О.Для выявления генетического марке - ра ревматизма - аллоантигена В-лим.эцитов Д 8/17, был применен предлагаемьй метод. Выделенные В-клетки вносили в тестовые лунки микрокамеры в количестве 0,001 мл в каждую; в опытные лунки были предварительно эакапаны моноклональные антитела ДЯ/17 в количестве 0,01 мл. Проводлиинкубацию В-.лимфоцитов с моноклональными анти- телами при +5 С в течение 8 щн, посоле чего добавлялн во все лунки 0,005 мл комплемента. Инкубацию на этапе комплемента проводили в течение 20 мин при 37,5 С. Производили окраску и фиксацию так же, как описано ранее. В результате. исследования выявле . но 203 "положительных" В-клеток, что свидетельствовало о наличии на В-лимфоцитах данного больного аллоантигена .Д 8-17-генетического маркера ревматизма и подтверждало диагноз.П р и м е р 2. Больная К-ва, 11 лет. В 1986 г у больной после переохлаждения отмечались явления артрита с преимущественным поражением мелких суставов стоп, голеностопньх, коленных суставов, лихорадка до 37,4 С. Состояние было расценено как ревматопдный артрит по поводу которого в течсние нескольких месяцев проводилось лечение. В ян5 1707542 Формула изобретения Составитель Р.Гуменюк"ехред М,Моргента-, Корректор М.Самборская Редактор Н 1 аэар гко Заказ 264 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Проиэво .ствоно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 варе 1989 года после ангины на фоне вновь появившихся явлений артрита впервые были отмечены гиперкинезы, раздражительность, плаксивость. При обследовании в клинике у больной выявлен зндомиокардит, малая хорея, что в сочетании с,лабораторными данными позволило поставить диагноз: ревматизм в активной Фазе, 11 ст, актив ности. Эндоююкардит с поражением митрального клапана. Малая хорея. Подострое течение Н-о. Перенесенньд ранее артрит расценен как первая атака ревматизма. 15Проведено выявление генетического . маркера ревматизма В-клеточногоаллоантигена Д 8/17 в микролгщфоцитотоксическом тесте, Были получены В-лим 4 оцйты, как описано в примере 1. Моно клональные антитела Д 8/17, внесенные в тестовь:е опыт.гые лупки микрокамеры, смешивались с 0,001 мл В-клеточной суспенэпей. В-клетки были также внесены в лунки опыт . Инкубация проводи25 лась в течение 12 мин при температуоре 4 С, после чего в лунки добавляли комплемент в коли естве 0,005 мл, микрокамсра помещалась в термсстат при температуре 38,С на 20 мин. Затем 30 проводилась окраска и Фиксация, как описано в примере 1. При подсчете ре зультата реакции получено 22 Е положительных" В-клеток, что подтверждает правильность постановки диагноза.Способ позволяет обнаружить аллоантиген Д 8/17 у 96 больных, что свидетельствует о закономерном характере носитсльства данного маркера у больных ревматизмом, Использование способа позволит без больших материальных затрат ускорить и упростить диагностику ревматизма. Способ диагностики ревматизма путем инкубации В-клеток с моноклональными антителами Д 8/17 с последующей оценкой результатов реакции иммунологическим методом и при выявлении нбсительства аллоантигена В-лимфоцитов диагностируют ревматизм, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, инкубацию осуществляют при 4-5 С в течение 8-12 мин дополнительно вносят комФо племент и инкубируют при 37 - 38 С в течение 20-25 мин, а результаты реакцгги оцснивают с помощью лимфоцитотоксического теста.