Способ определения пригодности микроносителя для культивирования клеток животных

;ц о 1703685 А 1 с.-1,5 С 12 Г, 5/00",су,чд,пстрг,"ьи ",ит;тпО изсь 1 е т Г. 1 иял, и с ытиям и/и гк; / ( с ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ РСКО ИДЕТЕЛЬСТ ОП НОС ЕТ М 1научно-исследовательский укторский институт приа ми я являе ия при ирован остове бируют ьция, а С Фаус В.А.Мак 8,8) Мее. С.В Сорокин.ет. а. (ппоуаооп п 5 р. 229 в 2, 1984, продукция и выращи тных. М: Колос. 1976 Ре ют на Известен сности микроносклеток животнотом, что клеткителе и в зависимтата делают внепригодностиОднако этоявляется длителся в течение 2 рования) и неделать однознамикроносителяточного ростамогут обуславлзанными с качемого микроносиЦель изобрни определенияля для культивиповышение досПоста вленнзультате того, чтель подвергаю и пределения пригоди для культивированияи, заключающийся в выращивают на микроносиости от полученного резульывод о пригодности или данного микроносителя. прямой метод определения ьным. так как осуществлчетсут (время цикла культиви позволяет во всех случаях ный вывод о непригодности поскольку отсутствие клели слабый клеточный рост ваться причинами, не святвом и природной испытуетеля.тения - сокращение време- пригодности микроносптерования клеток животных иерности результатов.цель достигается то испытуемый микро инкубации в растворе особ о телей ткан т тов ая в ре- носи- соли(56) Р,С.М, ЧапВ йесп по Г К 125Сергеев В.Авание вирусов жс. 303. Изобретение относится к биотехнологии и касается культивирования клеток животной ткани на микроносителях,Принцип выращивания клеток животной ткани на микроносителях является одним из наиболее перспективных поскольку позволяет значительно повысить выходы клеток, по сравнению с традиционными способами монослойного культивирования.При практической реализации этого принципа встречаются определе ные трудности, связанные, вчастности с тем что при одинаковых условиях культивирования выходы клеток могут значите,чьно варьировать, Весьма ощутимо могут изменяться выходы клеток и при использовании микро- носителей разных классов и при использовании различных серий одного и того же микроносителя. По этой причине освоение метода культивирования клеток животной ткани на микроносителях требует широкомасштабных предварительных исследоваий по подбору приемлемых микроносителей для каждой клеточной линии.(54) СПОСО СТИ МИКР РОВАНИЯ (57) Изобре гии и касае вотных н изобретени определендля культив вышение д этого инку ре соли кал осуществля зывания им ЕДЕЛЕНИЯ ПРИГОДНОИТЕЛЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИК ЖИВОТНЫХотносится к биотехнолоьтивирования к,четок жироносителях. Цегью тся сокращение времени одности микроносителя ия клеток животных и порности результатов, Для микроноситель в раствовывод о его пригодности сновании отсутствия свякальция. 1 табл, 1703685кальция определенной концентрации, отделяют взвешенные частицы микроносителя, в фильтрате определяют концентрациюионов кальция, определяют количествосорбированных ионов и по этой величинесудят о степени пригодности микроносителя для культивирования клеток животнойткани,Сущность предложенного способа заключается в том, что предварительно готовят раствор соли кальция определеннойконцентрации и диспергируют в этом растворе навеску испытуемого микроносителя.После некоторого времени инкубации взвешенные частицы удаляют фильтрованием,центрифугированием или иным методом, ав фильтрате определяют концентрациюионов кальция. Вычисляют убыль кальциевой соли за счет адсорбции на микроносителе и полученную величину рассматриваюткак показатель пригодности микроносителядля культивирования клеток животной ткани,Используемый раствор соли кальцияможет иметь различную концентрацию, ноудобнее готовить 0,1 М раствор.Испытание можно проводить в различном объеме, но наиболее оптимальным является объем 50 мл,Количество микроносителя, предназначенное для исследования, может колебатьсяв самых различных пределах, в среднем наобъем 50 мл раствора кальциевой соли достаточно 1,5 г микроносителя,В качестве кальциевой соли может бытьиспользована любая водорастворимая соль.Длительность инкубации. как и другиеколичественные характеристики, не имеетособого значения, однакодля исследованиядостаточно 60 мин,Метод определения от раствора взвешенных частиц микроносителя не имеетпринципиального значения,Инкубация микроносителя в растворежелательна в условиях, близких к условиям культивирования клеток животнойткани на микроносителе, т.е. ее можнопроводить при оптимальных для культурыклеток температуре и режиме перемешивания, Однако это условие не является обязательным.Количественное определение ионовкальция в фильтрате можно выполнить любым аналитическим методом, например методом пламенной фотометрии, ночувствительность метода не должна бытьочень низкой.Микроноситель, не сорбирующий ионыкальция, наиболее пригоден для культивирования клеток животной ткани,5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В случае сорбции микроносителем 10 и более ионов кальция из раствора он полностью непригоден для использования.При адсорбции микроносителем до 10 относительная пригодность его для практического использования тем выше, чем в меньшей степени он связывает ионы кальция.Пригодность некоторых микроносителей для культивирования клеток животной ткани и способность этих микроносителей связывать ионы кальция даны в таблице,Результирующие данные содержат в числителе величину, характеризующую степень сорбции микроносителем ионов кальция (в процентах), а в знаменателе - урожай клеток в расчете на 1 л среды, Во всех случаях культивирование клеток проводилось в одинаковых условиях на модифицированной среде Игла в течение 72 ч. Посевная концентрация составляла 0,4 10 кл/мл Кобличество использованного микроносителя 1,5 г. Культивирование проводилось в объеме 500 мл,П р и м е р 1. Микроноситель Гч. 14 ВНИИОЧБ в количестве 1,5 г инкубируют в течение 60 мин в 50 мл раствора 10 - М хлористого кальция, После инкубации микроноситель отделяют фильтрованием, в фильтрате с помощью пламенного фотометра ААз"Карл Пейс" определяют концентрацию ионов кальция, равную 0,29 г/л. Следовательно, микроноситель сорбировал 0,09 г/л ионов кальция, что соответствует 23,7.Этот микроноситель используют для культивирования клеток ВНК, С этой целью в объем модифицированной среды Игла, равный 500 мл, вносят 1,5 г микроносителя и 0,4 10 кл/мл ВНКв качестве посевного материала, Инкубирование продолжают 72 ч при температуре 36+1 С и интенсивности перемешивания 100 об/минУрожай клеток составил 0,8 10 кл/мл,бП р и м е р 2. Микроноситель Цитодекс(Сутобех 1, Рпагпзаса Гсп) в количестве 1,5 г инкубируют в течение 60 мин в 50 мл раствора хлористого кальция в концентрациии 10 М. После инкубации микроноситель отделяют фильтрованием, а в фильтрате методом пламенной фотометрии определяют концентрацию ионов кальция, равную 0,38 г/л, Следовательно, микроноситель практически не связан ионами кальция.Клетки ВНК, Чего инкубируют с этим микроносителем в условиях примеца 1.Урожай клеток составил 2,2 10 кл/мл, Как следует из изложенного, предложенный способ позволяет в сроки, не пре1703665 Микроноситель ЦИТОД ЦИТОДЦИТО М 50 ВН М. 14 ВН ВС-Ж В Иг 33 ВН Г 4 т 27 ВН Е КСЕКСЛАР ИИОЧБ ИИОЧБ НИИОЧ ИИОЧБ ИИОЧБ Составитель С, Светлышев. Гратилло Техред М.Моргентал орректор Т. Мал еда каз 40 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035. Москва, Ж, Раушская наб 4/5 иэводс нно-иэдательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 10 вышаюгцие 2 ч, определить приодность конкретного микроносителя для культивирования клеток животной ткани Благодаря этому сокращаются сроки исследований и получаются надежные результаты.Предлагаемый способ особенно пригоден для оценки качества отдельных партий микроносителей, что позволяет исключить большие колебания в урожаях клеток, зависящие от особенностей отдельных партий микронОСитЕля.Способ универсален в том смысле, что позволяет оценить пригодность носителя для культивирования различных клеточных линий, хотя, естественно, абсолютная урожайность клеток будет зависеть от особенностей клеточной линии и природы ми роносителя. Формула изобретения 5 Способ определения пригодностимикроносителя для культивирования клеток животных, включающий анализ микро- носителя с последующим суждением о его пригодности для культивирования клеток 10 животных,отл и чаю щи йс я тем, что, сцелью сокращения времени определения и повышения достоверности результатов, анализ микроносителя осуществляют путем его инкубирования в растворе соли кальция, 15 а суждение выносят на основании отсутствия связывания им ионов кальция.